Made available in DSpace on 2016-12-08T16:24:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGCA09MA035.pdf: 598667 bytes, checksum: ca72444a18cb4ea0606dce41b5264fb9 (MD5) Previous issue date: 2009-01-19 / O uso de sêmen congelado é um pré-requisito para maximizar o ganho genético oriundo da IA em ovinos. Muito embora a IA com sêmen fresco ou resfriado esteja consolidada, com sêmen congelado os resultados são inconsistentes. O uso de plasma seminal (PS) já foi demonstrado como eficaz na proteção e reversão de parte dos danos celulares causados pela criopreservação. Entretanto, o pequeno volume do ejaculado e o risco de transmissão de doenças espécie-específicas são limitações importantes nos ovinos. Uma alternativa a ser considerada é o uso de PS heterólogo, que pela escassez de informações disponíveis, justificam a execução deste estudo, cujos objetivos foram: (a) determinar a capacidade do PS eqüino (PSE) e bovino (PSB) em preservar a viabilidade do sêmen ovino descongelado, comparando-os com o PS ovino (PSO); (b) avaliar o perfil eletroforético das proteínas presentes no PSO, PSE e PSB, e adicionalmente; c) quantificar e comparar o nível de fragmentação do DNA de espermatozóides incubados ou não com PSO, PSE ou PSB. Para tanto, três experimentos foram conduzidos, sendo: Experimento 1: Sêmen descongelado diluído em meio sem PS (SPS) ou contendo 25% de PSO, PSE ou PSB, com exposição por um período de 5 min ou 6 h. Avaliou-se a motilidade, integridade de membrana plasmática e proporção de espermatozóides vivos. No Experimento 2 avaliou-se a concentração protéica total encontrada no PSO, PSE e PSB, bem como o perfil eletroforético das proteínas presentes, mediante SDS-PAGE. No Experimento 3 foi validada uma técnica para a avaliação da integridade do DNA espermático (Neutral Comet Assay - NCA), procedendo-se a avaliação de todos os tratamentos testados nos experimentos anteriores, além dos tratamentos: sêmen descongelado (SD), sêmen fresco (SF) e um controle positivo (CP). Adicionalmente foi avaliado o efeito da técnica de seleção espermática swim up sobre os achados de fragmentação de DNA pelo NCA. A análise estatística foi realizada com o pacote do SAS ou do Minitab, com nível de significância de 5%. Como resultados, observou-se que a exposição por 5 min. em PSO, PSE ou PSB teve efeito benéfico sobre os parâmetros de viabilidade avaliados. A incubação por 6 h reduziu (P<0,05) a motilidade espermática nos tratamentos PSE e PSO, em relação ao SPS e PSB. A integridade de membrana plasmática não foi afetada pelo tratamento. A concentração protéica total no PSO, PSE e PSB foi 16,8, 3,0 e 25,0 &#956;g/&#956;L, respectivamente. O PSO e PSB demonstraram padrões eletroforéticos semelhantes, enquanto o PSE apresentou um perfil distinto. A menor viii fragmentação de DNA com 1 h de incubação foi obtida com o grupo SF, não havendo diferença entre os demais grupos. Com 6 h de incubação, os grupos SPS (63%) e SD (70%) demonstraram maior fragmentação que o tratamento SF (50%), não havendo diferenças entre os tratamentos PSO (60%), PSE (52%) e PSB (55%). Não foi observado efeito da técnica de seleção swim up na fragmentação do DNA, avaliada pelo NCA. Conclui-se que o PS heterólogo pode ser utilizado em substituição ao PSO, mesmo apresentando perfil protéico distinto. Entretanto, a viabilidade espermática foi influenciada pelo tempo de incubação. Em adição, as modificações adotadas no método Neutral Comet Assay possibilitaram sua validação para o sêmen ovino. Por final, o sêmen ovino apresenta uma elevada taxa de fragmentação de DNA, que não difere entre os espermatozóides selecionados ou não pelo método swim up

Submitted by Jorge Silva (jorgelmsilva@ufrrj.br) on 2018-10-24T18:46:15Z No. of bitstreams: 1 2013 - Gisele Santos de Meireles.pdf: 16741114 bytes, checksum: 1d4b03cbd2287a0984257f70efb149da (MD5) / Made available in DSpace on 2018-10-24T18:46:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013 - Gisele Santos de Meireles.pdf: 16741114 bytes, checksum: 1d4b03cbd2287a0984257f70efb149da (MD5) Previous issue date: 2013-02-27 / CAPES / FAPERJ / This study aimed to determine from the protein profile of oocysts of Cystoisospora felis recovered from the sequential use of various purification techniques adapted for specific use in sporulated oocysts of C. felis. With the aid of SDS-PAGE 12% resulted in identification of 25 groups of protein: 266, 240, 186, 165, 140, 119, 112, 105, 98, 90, 78, 55, 47, 42, 37, 35, 30, 27-28, 25, 22, 19, 18, 16, 14 kDa belonging to the structure of sporulated oocysts and sporozoites of C. felis. Based on this results and heterologous bovine serum anti-C. felis was possible to determine polypeptides dominant relevant to diagnostic immunoassay technique with "Western Blotting", these being immunodominant bands: P208, P138, P113, p106, p62, p56, p51, p48, p44, p38, p36, and p33 p27. In order to avoid misdiagnosis from cross-reactivity a positive control serum anti-C. felis was compared to with positive serum anti-Toxoplasma and Neospora in order to exclude the common protein bands, probably markers of gender and group to identify cattle infected naturally or experimentally with C. felis. As showed, the following specific antigenic protein units: p 206-208, P137-139, p112- 113, p104-107, p27-28 are responsible for determining the animal tested positive or not for Cystoisospora felis. Of the analysis of the variables could be observed that the presence of felines related to the handling, size and type of milking properties facilitates dispersion C. felis. / Este trabalho teve por objetivo, diagnosticar a infec??o por Cystoisospora felis em bovinos atrav?s do Western Blotting, apartir de oocistos obtidos com o uso sequencial de v?rias t?cnicas de purifica??o adaptadas para o uso em oocistos esporulados de C. felis. Com o aux?lio do SDS-PAGE a 12 % resultou na identifica??o de 25 grupos proteicos de: 266; 240; 186; 165; 140; 119, 112, 105, 98, 90, 78, 55, 47, 42, 37, 35, 30, 27-28, 25, 22, 19, 18, 16, 14 KDa, pertencentes a estrutura dos oocistos esporulados e esporozoitas de C. felis. Com base nesse resultado e em soro de bovino heter?logo anti-C. felis foi poss?vel determinar os polipept?deos dominantes relevantes ? t?cnica de diagn?stico imunoenzimatico com ?Western Blotting?, sendo estas, as bandas imunodominantes: p208, p138, p113, p106, p62, p56, p51, p48, p44, p38, p36, p33 e p27. A fim de evitar o diagn?stico equivocado a partir de rea??es cruzadas foi feita a compara??o do soro controle positivo anti-C. felis com o soro positivo anti-Toxoplasma e Neospora com o intuito de excluir as bandas proteicas comuns, prov?veis marcadoras de g?nero e grupo para identifica??o de bovinos infectados de maneira natural ou experimental com C. felis. Sendo evidenciadas, as seguintes unidades proteicas antig?nicas espec?ficas: p 206-208, p137-139, p112-113, p104-107, p27-28 respons?veis por determinar a positividade dos animais testados para C. felis. A partir das an?lises das vari?veis foi poss?vel observar que a presen?a de felinos associados, ao manejo, tipo de ordenha e tamanho das propriedades facilita a dispers?o de C. felis.