Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2018-09-04T12:41:05Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2165872 bytes, checksum: 7b20ed84916fcf93be218e2ce4393822 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-09-04T12:41:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2165872 bytes, checksum: 7b20ed84916fcf93be218e2ce4393822 (MD5) Previous issue date: 2018-02-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A ordem Hemiptera compreende um grupo diversificado de insetos com cerca de 89 mil espécies descritas e agrupadas nas quatro subordens: Heteroptera, Sternorrhyncha, Coleorrhyncha e Auchenorrhyncha. Esta última possui mais de 25 mil espécies descritas dentro de duas grandes infraordens: Cicadomorpha (Cercopoidea, Cicadoidea e Membracoidea) e Fulgoromorpha (Fulgoroidea). A subordem Heteroptera é dividida nas infraordens: Enicocephalomorpha, Dipsocoromorpha, Gerromorpha, Nepomorpha, Leptopodomorpha, Pentatomomorpha e Cimicomorpha. Ela possui mais de 400 mil espécies descritas que podem ser predadoras, fitófagas e hematófagas caracterizando essa subordem como de importância econômica e de saúde pública. As relações filogenéticas dentro dos Auchenorrhyncha e dos Heteroptera ainda são temas de muito debate. O conhecimento da biologia reprodutiva e da morfologia dos espermatozoides podem contribuir para estudos taxonômicos e filogenéticos dessas duas subordens. Nesse contexto, no presente trabalho descrevemos, usando as microscopias de luz e eletrônica de transmissão, a estrutura e ultraestrutura dos espermatozoides de Dalbulus maidis e Collaria oleosa e Prepops zetterstedti. No primeiro capítulo, nós redescrevemos os espermatozoides de D. maidis, que mediram de 118,1-128,5 μm de comprimento, sendo este valor cerca de três vezes menor do que o descrito anteriormente. A região da cabeça é formada por acrossomo e núcleo. O acrossomo é paracristalino e tem a base bifurcada que está encaixada em duas cavidades em um lado da região anterior do núcleo. O núcleo mediu 19,3-22,9 μm de comprimento e, em corte transversal, exibiu a forma de meio lua com uma fina projeção central, mas nas extremidades ele se mostrou oval. O flagelo consistiu de um axonema com 9+9+2 microtúbulos, dois derivados mitocondriais simétricos, dois corpos acessórios associados a uma pequena estrutura sub-elipsoidal e um "material centro-flagelar". A porção final do flagelo de todos os espermatozoides era ramificada em três filamentos. No segundo capítulo nós caracterizamos morfologicamente os espermatozoides de dois percevejos da família Miridae, C. oleosa e P. zetterstedti. Os espermatozoides de C. oleosa e P. zetterstedti mediram 171,3 μm e 276,0 μm de comprimento, dos quais 24,7 μm e 27,2 μm representaram o núcleo, respectivamente. Em ambas espécies, essas células apresentaram na região de cabeça um acrossomo e núcleo, e no flagelo um axonema de 9+9+2 microtúbulos e dois derivados mitocondriais simétricos. Em C. oleosa, não em P. zetterstedti, o acrossomo é revestido por uma espessa camada de material denso. Na transição núcleo-flagelo das duas espécies foi observado um longo adjunto do centríolo cilíndrico formando uma ponte entre núcleo e os componentes flagelares, essa característica é exclusiva para Miridae. / The order Hemiptera comprises a diverse group of insects with about 89 thousand species described and group in four suborders: Heteroptera, Sternorrhyncha, Coleorrhyncha and Auchenorrhyncha. The latter has more than 25 thousand species described within two major infraorders: Cicadomorpha (Cercopoidea, Cicadoidea and Membracoidea) and Fulgoromorpha (Fulgoroidea). The suborder Heteroptera is divided in the infraordens: Enicocephalomorpha, Dipsocoromorpha, Gerromorpha, Nepomorpha, Leptopodomorpha, Pentatomomorpha and Cimicomorpha. It has more than 400 thousand species described that can be predatory, phytophagous and hematophagous, characterizing this suborder as of economic importance and public health. Phylogenetic relationships within Auchenorrhyncha and Heteroptera are still subjects of much debate. The knowledge of reproductive biology and morphology of spermatozoa can contribute to taxonomic and phylogenetic studies of these two suborders. In this context, the present work described, using light microscopy and transmission electron microscopy, the structure and ultrastructure of spermatozoa of Dalbulus maidis, Collaria oleosa and Prepops zetterstedti. In the first chapter, we redescribed the spermatozoa of D. maidis, which measured 118.1-128.5 μm in length, being about three times smaller than that previously described. The head region is formed by acrosome and nucleus. Acrosome is paracrystalline and has a bifurcated base which was docked in two cavities on one side of the anterior region of the nucleus. The nucleus measured 19.3-22.9 μm in length and, in cross section, showed a half-moon shape with a thin central projection, but at the extremities it was oval. The flagellum consisted of an axonema with 9+9+2 microtubules, two symmetrical mitochondrial derivatives, two accessory bodies associated with a small sub-ellipsoidal structure and a ‘center-flagellar material’. The final portion of the flagellum of all spermatozoa was branched into three filaments. In the second chapter, we morphologically characterized the spermatozoa of two Miridae bugs, C. oleosa and P. zetterstedti. The spermatozoa of C. oleosa and P. zetterstedti measured 171.3 μm and 276.0 μm in length, of which 24.7 μm and 27.2 μm represented the nucleus, respectively. In both species, the head region presented acrosome and nucleus, and in the flagellum an axoneme of 9+9+2 microtubules and two symmetrical mitochondrial derivatives. Only in C. oleosa, not in P. zetterstedti, acrosome is coated by a thick layer of dense material. In the nucleus-flagellum transition of the two species a long cylindrical centriole adjunct forming a bridge between the nucleus and flagellar components was observed, this feature is exclusive to Miridae.

Submitted by LUÍS LENIN VICENTE PEREIRA null (luislenin@gmail.com) on 2017-03-02T15:07:34Z No. of bitstreams: 1 Tese Luis Lenin Vicente Pereira.pdf: 2894913 bytes, checksum: 01d77fed0e0eb6b5cfb7979e52829667 (MD5) / Approved for entry into archive by LUIZA DE MENEZES ROMANETTO (luizamenezes@reitoria.unesp.br) on 2017-03-08T13:17:27Z (GMT) No. of bitstreams: 1 pereira_llv_dr_sjrp.pdf: 2894913 bytes, checksum: 01d77fed0e0eb6b5cfb7979e52829667 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-08T13:17:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 pereira_llv_dr_sjrp.pdf: 2894913 bytes, checksum: 01d77fed0e0eb6b5cfb7979e52829667 (MD5) Previous issue date: 2017-02-17 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A subordem Heteroptera possui sete infraordens com aproximadamente 80 famílias. A maioria ocorre em todos os continentes (exceto Antártica) e algumas ilhas. Além dos Heteroptera terrestres, há os aquáticos e semi-aquáticos que são amplamente distribuídos, e surpreendem por sua capacidade de habitar uma extraordinária variedade de ecossistemas, sendo encontrados em habitats de água doce e marinho, e variada faixa de altitude entre 0 e 4.700 m. Estudos sobre aspectos ultraestruturais da espermatogênese e, especificamente, a estrutura do espermatozoide em Heteroptera ainda são escassos, por este motivo o objetivo do presente estudo foi o de analisá-los, por meio de cortes semifinos corados com azul de toluidina ou impregnados por íons prata, e cortes ultra-finos analisados em microscopia eletrônica de transmissão, utilizando testículos de machos adultos das famílias Belostomatidae, Gelastocoridae, Gerridae, Mesoveliidae, Notonectidae e Veliidae. Após a análise ultraestrutural da espermatogênese foi possível determinar que o padrão flagelar do axonema é de 9+9+2 para todas as espécies analisadas sendo, portanto, o padrão para essa subordem, as mitocôndrias durante a espermatogênese assumem diferentes morfologias, sendo que inicialmente as mitocôndrias se unem formando o complexo mitocondrial e, posteriormente, se divide em dois derivados mitocondriais que estão posicionados bilateralmente em relação ao axonema. Os derivados mitocondriais apresentaram tamanhos diferentes para as espécies B. amnigenus (Notonectidae) e R. c. crassifemur (Gerridae) e para as demais espécies o tamanho foi semelhante. As células germinativas possuem em seu citoplasma o acúmulo de um material denominado corpo cromatóide estando localizado próximo ao núcleo. Com relação ao comportamento nucleolar da espécie Martarega brasiliensis foi observado de um a quatro corpúsculos nucleolares em células de Prófase I comprovando uma grande atividade sintética das células nessa fase da divisão celular. Células em Metáfase I apresentaram regiões organizadoras nucleolares na região telomérica de um dos autossomos. Ainda, nessa espécie, foi possível observar, em Anáfase I, vários corpúsculos nucleolares persistindo até a fase de Telófase I. Todas as ultraestruturas descritas nas espécies analisadas foram semelhantes às descritas na literatura para Heteroptera, corroborando as características sinapomórficas dessa subordem sendo elas: a) a presença de duas pontes que ligam o material intertubular do axonema flagelar às cisternas achatadas que aderem aos lados internos dos derivados mitocondriais; b) padrão flagelar do axonema de 9+9+2 e c) ausência de corpos acessórios. / The suborder Heteroptera has seven infraorders with approximately 80 families. Most occur in all continents, except Antarctica and some islands. In addition to terrestrial Heteroptera, there are also widely distributed aquatic and semi-aquatic species. This suborder have adapted to live in an extraordinary variety of ecosystems as freshwater and marine habitats and at altitudes ranging from 0 m to 4,700 m. The research concerning the ultrastructural aspects of spermatogenesis is a large and growing field of study, however, in the case of Heteroptera, research is still scarce. For this reason, the aim of this study was to analyze the ultrastructures and spermatogenesis through semi-thin sections stained with toluidine blue or silver ions (Ag-NOR) and ultrathin sections examined in transmission electron microscopy, using testes of adult males ofthe following families: Belostomatidae, Gelastocoridae, Gerridae, Mesoveliidae, Notonectidae and Veliidae. After ultrastructural analysis of spermatogenesis, it was possible to determine that the flagellar pattern of the axoneme is 9+9+2 for all species, being therefore, the pattern for this suborder. As spermatogenesis progresses, the mitochondria begins to cluster and concentrate on only one side of the cell. Then, the mitochondria combine to form a single mitochondrial complex, which subsequently divides into two mitochondrial derivatives. They are positioned on opposite sides of the axoneme. The mitochondrial derivatives presented different sizes for the species B. amnigenus (Notonectidae) and R. c. crassifemur (Gerridae) and for the other species the size was similar. The germ cells have in their cytoplasm the accumulation of a material denominated the chromatoid body, being located near the nucleus. Regarding the nucleolar behavior, M. brasiliensis showed nucleus in prophase I composed by the nucleolus and nucleolar corpuscles that varied from one to four, emphasizing that this insect has great synthetic activity during meiosis. The analysis of cells in metaphase I, showed that M. brasiliensis presents nucleolar organizing region (NOR) in at least one autosome. Furthermore, was not observed the phenomenon of nucleolar persistence. All the ultrastructures described in the analyzed species were similar to those described in the literature for Heteroptera, corroborating the synapomorphic characteristics of this suborder, being them: a) two opposite bridges in the axoneme connect the flattened cisterns adherent to the internal side of each mitochondrial derivative to the intertubular material; b) flagellar pattern of the axoneme of 9+9+2; c) accessory bodies are absent all along the flagellum.

Submitted by Fernando Cesar Silva Junior null (ju_fcsj@hotmail.com) on 2016-03-11T04:12:41Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_Fernando_Online.pdf: 4129284 bytes, checksum: 6fbd44eda2ee6b9b62753d8e00cd09a5 (MD5) / Approved for entry into archive by Felipe Augusto Arakaki (arakaki@reitoria.unesp.br) on 2016-03-14T17:46:40Z (GMT) No. of bitstreams: 1 silvajunior_fc_me_sjrp.pdf: 4129284 bytes, checksum: 6fbd44eda2ee6b9b62753d8e00cd09a5 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-14T17:46:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 silvajunior_fc_me_sjrp.pdf: 4129284 bytes, checksum: 6fbd44eda2ee6b9b62753d8e00cd09a5 (MD5) Previous issue date: 2016-02-25 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Heteroptera é uma Subordem da Ordem Hemiptera, que possui cerca de 40 mil espécies distribuídas em oitenta famílias, dentre elas está a família Pentatomidae que se destaca por ser uma das maiores famílias com cerca de 4.100 espécies, representando, aproximadamente, 11% do total de espécies de Heteroptera. As espécies de Pentatomidae Chinavia impicticornis, Edessa meditabunda, E. collaris e Thyanta perditor foram estudadas nesse trabalho devido ao sua importância econômica, tendo em vista que são espécies fitófagas que causam grandes perdas em diversas culturas. Os machos das espécies foram coletados na região de São José do Rio Preto, os testículos foram fixados e posteriormente processados para analise em microscopia eletrônica de transmissão, os blocos obtidos foram trimados, cortados, contrastados e analisados com microscópio eletrônico de transmissão Leo – Zeiss, do Centro de Microscopia e Microanálise (IBILCE-UNESP, São José do Rio Preto, SP) e com o microscópio eletrônico de transmissão Jeol JEM - 100 CXII da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP-USP). As eletromicrografias das espécies estudadas apresentaram características ultraestruturais semelhantes às encontradas para diversos indivíduos de diferentes ordens, dentre essas características estão a formação do acrossomo, a partir de uma grande vesícula secretada pelo complexo de Golgi e que se localiza na região apical/lateral do núcleo. O núcleo, também, sofre transformações semelhantes às relatadas para grande parte dos insetos passando de um estado grande e esférico com a cromatina dispersa para um estado pequeno e fusiforme e com a cromatina extremamente condensada. Outra estrutura observada foi o adjunto do centríolo que se mostrou uma estrutura eletrondensa na região basal do núcleo. Também foi observada a migração das mitocôndrias para um polo celular e sua posterior fusão formando o complexo mitocondrial ou “Nebenkern”, que, posteriormente, se divide formando os dois derivados mitocondriais simétricos, com a presença de estruturas paracristalinas em seu interior. O padrão de microtúbulos encontrado no axonema, para todas as espécies, foi de 9+9+2, típico de insetos, sendo formado entre os derivados mitocondriais e acompanhado por estes ao longo de quase toda sua extensão. Morfologicamente, os derivados mitocondriais são diferentes entre C. impicticornis, E. meditabunda, E. collaris e T. perditor onde foi possível notar que os derivados de C. impicticornis se apresentaram grandes e arredondados, E. meditabunda pequenos e arredondados, E. collaris alongados e com extremidades arredondadas e T. perditor pequenos com uma extremidade arredondada e a outra angular podendo estas diferenças morfológicas serem características interessantes para futuros estudos filogenéticos ou sistemáticos para o grupo. Portanto, podemos concluir que a maioria das características analisadas é semelhante entre os insetos, com exceção da morfologia dos derivados mitocondriais que são diferentes, até mesmo, entre as espécies da família Pentatomidae. / Heteroptera is a suborder of the Hemiptera order, which has approximately 40,000 species distributed in eighty families, among them is the Pentatomidae family that stands out for being one of the largest families with approximately 4,100, representing approximately 11% of the total species of Heteroptera. The species of Pentatomidae Chinavia impicticornis, Edessa meditabunda, E. collaris and Thyanta perditor were studied in this work because of their economic importance, given that they are phytophagous species that cause great losses in several crops. Males of the species were collected in the region of São José do Rio Preto, the testes were fixed and then processed for analysis by transmission electron microscopy, the obtained blocks were trimmed, cut, contrasted and analyzed with transmission electron microscope Leo - Zeiss, of the Centro de Microscopia e Microanálise (IBILCE-UNESP, São José do Rio Preto, SP) and the transmission electron microscope Jeol JEM - 100 CXII of Faculdade de Medicina of Ribeirão Preto (FMRP-USP). The species have similar ultrastructural characteristics to those found in many individuals of different orders, among these features is the acrosome formation from a large vesicle secreted by Golgi apparatus and located in the apical/lateral area of the nucleus. The nucleus also undergoes changes similar to those reported for most insects, passing of a great and spherical state with chromatin dispersed to a small and fusiform state and highly condensed chromatin. Another structure was observed the centriolar adjunct that showed electrodense structure in the basal region of the nucleus. We also observe the migration of mitochondria for the cell and its subsequent fusion was observed forming the mitochondrial complex or “Nebenkern”, which later splits to form two symmetrical mitochondrial derivatives, with the presence of paracrystalline structures inside. The pattern of microtubules found on the axonema, for all species was 9+9+2, typical of insects, being formed between the mitochondrial derivatives and accompanied by such over almost its entire length. Morphologically, the mitochondrial derivatives are different between C. impicticornis, E. meditabunda, E. collaris and T. perditor where it was possible to note that C. impicticornis derivatives showed large and rounded, E. meditabunda small and rounded, E. collaris elongated and rounded ends and T. perditor smaller with one rounded end and the other angled being able these morphological differences are interesting features for future phylogenetic or systematic studies for the group. Therefore, we can conclude that the analyzed characteristics are most similar among the insects, with the exception of the morphology of the mitochondrial derivatives which are different even among the species of the Pentatomidae family.

Orientador: Maria Tercília Vilela de Azeredo Oliveira / Resumo: A subordem Heteroptera possui uma enorme diversidade de insetos distribuída em sete infraordens, dentre as quais utilizamos Gerromorpha, Nepomorpha, Cimicomorpha e Pentatomomorpha. As espécies que foram estudadas da primeira infraordem, representando os insetos semi-aquáticos, são Limnogonus aduncus e Mesovelia mulsanti, da segunda infraordem, representando os aquáticos, são Belostoma anurum, Martarega sp. e Buenoa unguis, da terceira infraordem Zelus sp. e Teleonemia sp. e da última infraordem, representando juntas os terrestres, são Largus sp., Stenocoris sp., Zicca pulchra e Dysdercus sp. para descrever as ultraestruturas de suas espermátides e posterior comparação. Durante o processo de espermiogênese em geral, ocorre uma série de modificações nas espermátides antes dessas serem transformadas em espermatozoide, inclusive nos insetos. Neste trabalho verificamos por meio da Microscopia Eletrônica de Transmissão, as modificações ocorridas nas espermátides das infraordens anteriormente mencionadas. Na maioria dos insetos com hábitat aquático foi identificada uma maior variação morfológica com relação aos derivados mitocondriais, apresentando-se tanto com simetria reniforme, com simetria e padrão diferente, quanto com assimetria. Com relação aos terrestres, foi identificado predominantemente um padrão morfológico reniforme com uma área de cada derivado mitocondrial menor que a do axonema. Somente a espécie B. unguis, de hábitat aquático, evidenciou um padrão atípico, assimétri... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The suborder Heteroptera has an enormous diversity of insects distributed in seven infraorders, among which Nepomorpha, Gerromorpha, Pentatomomorpha e Cimicomorpha, The species that have been studied from the first infraorder, representing semi-aquatic insects, are Limnogonus aduncus and Mesovelia mulsanti, from the second order, representing the aquatic ones, Belostoma anurum, Martarega sp. and Buenoa unguis, from the third infraorder Zelus sp. and Teleonemia sp. and the last infraorder, representing terrestrials together, are Largus sp., Stenocoris sp., Zicca pulchra and Dysdercus sp. to describe the ultrastructures of their spermatides and further comparison. During the spermiogenesis process in general, a series of changes in spermatids occur before they are transformed into sperm, including in insects In this work we verified through Transmission Electron Microscopy, the changes occurred in the spermatids of the abovementioned infraorders. In the majority of insects with aquatic habitat, a greater morphological variation was identified in relation to mitochondrial derivatives, presenting both with reniform symmetry, with different symmetry and pattern, and with asymmetry. With respect to terrestrials, a predominantly reniform morphological pattern was identified with an area of each mitochondrial derivative smaller than the axoneme. Only the species B. unguis, of aquatic habitat, showed an atypical, asymmetric pattern of mitochondrial derivatives, in relation to that com... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:46:41Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / funcionais nos espermatozoides e o nivel seminal de peroxidacao lipidica. Metodo: Um estudo transversal foi realizado incluindo 156 pacientes normozoospermicos. Apos a coleta do semen por masturbacao, uma aliquota foi utilizada para a analise seminal e outra para a avaliacao da atividade mitocondrial, da integridade do acrossoma e da integridade do DNA dos espermatozoides. O volume remanescente de semen foi centrifugado e o plasma seminal sobrenadante foi utilizado para a avaliacao do nivel seminal de peroxidacao lipidica e para a analise proteomica. Posteriormente, os pacientes foram divididos em percentis (15%) para formacao dos grupos experimentais de cada estudo: Estudo 1 - alta (grupo controle) e baixa (grupo alterado) atividade mitocondrial dos espermatozoides, Estudo 2 - alta (grupo controle) e baixa (grupo alterado) integridade do acrossoma dos espermatozoides, Estudo 3 - baixa (grupo controle) e alta (grupo alterado) fragmentacao do DNA dos espermatozoides e Estudo 4 - baixo (grupo controle) e alto (grupo alterado) niveis seminais de peroxidacao lipidica. A analise proteomica foi realizada utilizando LCMS/MS. Os grupos foram comparados por meio de analise univariada (teste t de Student) e analise multivariada (PLS-DA e analise discriminante). As proteinas significantes foram posteriormente submetidas a analise de enriquecimento funcional. Resultados: Nos estudos 1, 2, 3 e 4 foram observadas 506, 493, 474 e 629 proteinas, respectivamente. As funcoes enriquecidas no estudo 1 foram detoxificacao de EROs e ligacao a NADP (controle) e atividade de oxidoredutase intramolecular, catabolismo de aminoglicanos, inibicao de endopeptidases, lisossomos e resposta imune de fase aguda (alterado). As principais funcoes enriquecidas no estudo 2 foram resposta imune (controle) e inibicao de fosfolipase, metabolismo do acido araquidonico, exocitose, resposta inflamatoria aguda, resposta ao peroxido de hidrogenio e transporte lisossomal (alterado). As principais funcoes enriquecidas no estudo 3 foram metabolismo de carboidratos, regulacao de lipoproteinas, regulacao negativa da apoptose, metabolismo de hormonios, atividade de metalopeptidases, ligacao ao NAD e lisossomos (controle) e biossintese de prostaglandinas e ligacao a acidos graxos (alterado). As principais funcoes enriquecidas no estudo 4 foram biossintese de acidos graxos insaturados, atividade de oxidantes e antioxidantes e resposta celular ao estresse termico (alterados). Nos estudos 1, 2, 3 e 4 foram sugeridos 8, 6, 8 e 7 biomarcadores seminais de atividade mitocondrial, integridade acrossoma, fragmentacao de DNA e peroxidacao lipidica, respectivamente. Conclusoes: O perfil proteomico do plasma seminal reflete alteracoes funcionais dos espermatozoides e o nivelseminal de peroxidacao lipidica e diversas funcoes pos-genomicas estao relacionadas as alteracoes estudadas. Proteinas relacionadas as alteracoes funcionais dos espermatozoides e ao nivel seminal de peroxidacao lipidica constituem potenciais biomarcadores seminais para cada alteracao / Objective: To verify if the seminal plasma proteomic profile reflects sperm functional alteration and semen lipid peroxidation levels. Method: A cross-sectional study was performed including 156 normozoospermic patients. After semen retrieval by masturbation, an aliquot was utilized for semen analysis and another for evaluation of sperm mitochondrial activity, acrosome integrity and DNA fragmentation. The remaining semen volume was centrifuged and the supernatant seminal plasma was utilized for semen lipid peroxidation levels evaluation, and proteomic analysis. Patients were divided into percentiles (15%) to form the experimental groups: Study 1 – high (control group) and low (altered group) sperm mitochondrial activity; Study 2 – high (control group) and low (altered group) sperm acrosome integrity; Study 3 – low (control group) and high (altered group) sperm DNA fragmentation; Study 4 – low (control group) and high (altered group) semen lipid peroxidation levels. Proteomic analysis was performed by a LC-MS/MS approach. Groups were compared using univariate (Student’s t test) and multivariate (PLS-DA and discrimant analysis) analyses. Differentially expressed proteins were then utilized for functional enrichment analysis. Results: 506, 493, 474, and 629 proteins were observed in studies 1, 2, 3, and 4, respectively. Enriched functions in study 1 were reactive oxygens species detoxification, and NADP binding (control group), and intramolecular oxidoreductase activity, aminoglycans catabolism, endopeptidases inhibition, lysosomes, and acute-phase response (altered group). In study 2, main enriched functions were acute-phase response (control group), and phospholipase inhibition, arachidonic acid metabolism, exocytosis, regulation of acute inflammatory response, response to hydrogen peroxide and lysosomal transport (altered group). In study 3, main enriched functions were carbohydrates metabolism, lipoprotein regulation, negative regulation of apoptosis, hormone metabolism, metalopeptidases activity, NAD binding, and lysosomes (control group), and prostaglandin biosynthesis, and fatty acid binding (altered group). In study 4, enriched functions were unsaturated fatty acid biosynthesis, oxidants and antioxidants activity, and cellular response to heat stress (altered group). In total, 8, 6, 8, and 7 seminal biomarkers were proposed for studies 1 (mitochondrial activity), 2 (acrosome integrity), 3 (DNA fragmentation), and 4 (lipid per oxidation), respectively. Conclusions: The seminal plasma proteomic profile reflects sperm functional alterations and semen lipid perodixation levels, and several post-genomic functions are related to the studied alterations. Proteins related to sperm functional alterations, and semen lipid peroxidation levels constitute potential seminal biomarkers for each alteration. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:55Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-02-27 / Objetivos:Avaliar o efeito da varicocele na integridade do DNA nuclear,na atividade mitocondrial,na peroxidação lipídica e na integridade acrossômica dos espermatozóides.Métodos:as amostras foram obtidas e analisadas de acordo com os parâmetros da OMS(1999) e morfologia segundo critério estrito de Kruger.O grupo de estudo incluiu 30 homens com varicocele grauII ou III e o grupo controle incluiu 32 homens sem varicocele.A integridade do DNA nuclear dos espermatozóides foi avaliada pelo ensaio Cometa alcalino, e as células foram classificadas de acordo com a intensidade de dano no DNA:grau I(alta integridade do DNA),grau II(DNA ainda íntegro ou em início de fragmentação),grau III(DNA moderadamente fragmentado)e grau IV(DNA altamente fragmentado).A atividade mitocondrial foi avaliada pelo método colorimétrico proposto por Hrudka(1987),e as células foram classificadas em:classe I(mitocôndrias todas ativas),classe II (mais de 50 por cento de mitocôndrias ativas),classe III(menos de 50 por cento de mitocôndrias ativas)e classe IV(mitocôndrias todas inativas).A peroxidação lipídica foi determinada usando-se o método descrito por Ohkawa(1979),que se baseia na determinação de MDA devido à sua reação com o TBA, e o nível de peroxidação lipídica foi descrito em nanogramas de TBARS/mL de sêmen.A integridade do acrossoma foi avaliada através da sonda fluorescente PNA(Peannut Agglutinin)-FITC (Fluorescein isothiocyanite)conjugada, e o resultado foi expresso em porcentagem de espermatozóides com acrossoma íntegro.Resultados: quanto à integridade do DNA,o grupo de homens com varicocele apresentou uma menor porcentagem de espermatozóides com DNA nuclear íntegro(grau II, p=0,040).Não houve diferença na porcentagem de células grau I,III e IV.Quanto à atividade mitocondrial, o grupo de homens com varicocele apresentou uma porcentagem maior de espermatozóides com mitocôndrias inativas(classe III, p=0,020)e uma porcentagem menor de espermatozóides com mitocôndrias ativas(classe I, p=0,005).Não houve diferença na porcentagem de células classe II e IV.Quanto à integridade acrossômica, o grupo de homens com varicocele apresentou uma menor porcentagem de espermatozóides com acrossoma íntegro(p=0,0002).Por fim, com relação ao nível de peroxidação lipídica,não foi encontrada nenhuma diferença estatisticamente significante entre os grupos com e sem varicocele.Conclusões: Neste estudo, homens com varicocele apresentaram um aumento nas taxas de fragmentação de DNA e uma redução na atividade mitocondrial e na integridade acrossômica dos espermatozóides.Todavia, nenhuma diferença entre os níveis seminais de MDA foi encontrada, o que sugere que talvez as alterações funcionais encontradas não estejam associadas diretamente com o estresse oxidativo, ou que o estresse oxidativo leve a alterações no DNA, mitocôndrias e acrossoma durante a espermatogênese, e não após a ejaculação / Objectives: to assess the effect of varicocele on sperm nuclear DNA integrity, mitochondrial activity, lipid peroxidation and acrosome integrity. Methods: semen samples were obtained and analyzed according to the World Health Organization guidelines (1999) and sperm morphology was evaluated by Kruger’s strict criteria (1986). The study group included 30 men with varicocele grades II or III and the control group included 32 men without varicocele. Sperm nuclear DNA integrity was assessed by the alkaline Comet assay, and cells were graded according to the intensity of DNA damage: class I (high DNA integrity), class II (DNA still intact or initiating fragmentation), class III (DNA fairly fragmented) and class IV (DNA extremely fragmented). Mitochondrial activity was evaluated by the colorimetric method proposed by Hrudka (1987). Cells were classified according to the proportion of active mitochondria: class I (100% of active mitochondria), class II (more than 50% of active mitochondria), class III (less than 50% of active mitochondria) and class IV (100% of inactive mitochondria). Lipid peroxidation was determinated by Ohkawa’s method, which is based on the measurement of malondialdehyde (MDA) due to its reaction with thiobarbituric acid (TBA), and the levels of lipid peroxidation were described as nanograms of TBARS/mL. Acrosome integrity was assessed by use of the conjugated fluorescent probe PNA-FITC and the results were expressed in percentages of intact acrosomes (fluorescence was observed over the entire acrosomal region of the sperm head). Results: Concerning DNA integrity, the varicocele group showed less spermatozoa with intact nuclear DNA (grade II, p=0,040). There was no significant difference in classes I, III and IV between the two groups. Regarding mitochondrial activity the varicocele group showed more cells with inactive mitochondria (class III, p=0,001) and less cells with active mitochondria (class I, p=0,005). There was no difference in classes II and IV. Also, the varicocele group showed less spermatozoa with intact acrosomes (p=0,0002), when compared to the controls. Finally, no significant differences were observed in lipid peroxidation levels. Conclusions: This study was able to demonstrate that varicocele in adults is associated with increased DNA fragmentation, reduced mitochondrial activity and decreased acrosome integrity even when semen quality does not differ from men without varicocele. However, levels of seminal products of lipid degradation (MDA) are not increased in these patients, suggesting that perhaps the functional changes found are not directly associated with oxidative stress, or that oxidative stress leads to changes in DNA, acrosomes and mitochondria during spermatogenesis, and not after ejaculation. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações