A ineficiência dos protocolos de criopreservação limita o uso em larga escala da produção in vitro de embriões bovinos. O objetivo deste trabalho foi identificar os danos causados pela criopreservação e pelo cultivo embrionário de embriões bovinos produzidos in vitro após a descongelação, avaliando a morfologia, a expressão gênica e o desenvolvimento in vitro antes e após a criopreservação. Complexos cummulusoócitos foram maturados, fecundados e cultivados in vitro. Blastocistos expandidos (n=600) obtidos entre os dias 7 e 9 de cultivo (fecundação D0) foram submetidos a congelação controlada (grupo controlado: 10% de etileno glicol (EG) por 10 minutos, 1,2oC por minuto), congelação rápida (grupo rápido: 10% de EG por 10 minutos , 20% de EG + 20% de Glicerol (Gli) por 30 segundos) ou vitrificação (grupo vitrificação: 10% de EG por 10 minutos, 25% EG + 25% Gli por 30 segundos). Os embriões do grupo controle não foram expostos a crioprotetores e nem a protocolos de criopreservação, sendo avaliado o índice de eclosão 12 dias após a fecundação (46,09%). As palhetas para os protocolos de congelação rápida e vitrificação foram mantidas em vapor de nitrogênio líquido (0,8cm sobre o líquido) por 2 minutos e imersas no nitrogênio líquido. Os embriões foram descongelados por 10 segundos em ar e 20 segundos em banhomaria a 25oC. Os embriões foram reidratados em solução de PBS + 0,2% de BSA + 0,3M de sacarose e em solução de PBS + 0,2% de BSA ambos por 3 minutos. Para avaliar o desenvolvimento, os embriões, após a descongelação, foram co-cultivados com células da granulosa em meio TCM199 ou SOFaa por 4 dias. Os dados foram analisados com o aplicativo PROC MIXED do programa SAS Sistems for Windows®. O grupo controlado apresentou índices de eclosão de 44,65% ± 5,94 e 11,65 ± 3,37 para o meio TCM199 e para o meio SOFaa, respectivamente. Embriões do grupo rápido não apresentaram eclosão, independente do meio de cultivo. O grupo vitrificação apresentou índices de eclosão de 9,43% ± 6,77 e 8,67% ± 4,47, respectivamente, em meio TCM199 e SOFaa. Os valores foram significativos quando p<0,05. O grupo controlado apresentou diferença em relação aos outros grupos em ambos os meios de cultivo. No meio TCM199 os índices de re-expansão e eclosão foram mais altos. Para a análise da expressão gênica, 2 pools de 10 blastocistos expandidos de embriões frescos e criopreservados (congelação controlada) foram utilizados para a extração de RNA. Foi feita reação de Transcrição Reversa (RT-PCR) e de PCR em Tempo Real. Os resultados da reação de PCR em Tempo Real demonstraram que a quantidade de material não foi suficiente para a amplificação de produtos em todas as reações. Concluindo, o meio de cultivo TCM199 exerce influência sobre o desenvolvimento embrionário após a criopreservação, sendo mais apropriado do que o meio SOFaa. E, para proceder a análise da expressão gênica pela reação de PCR em Tempo Real é necessário número maior de blastocistos expandidos. / The inefficiency of embryo cryopreservation protocols limits the broad use of in vitro production (IVP) of bovine embryos. The aim of this work was to identify the damage caused by cryopreservation and embryo culture of in vitro produced bovine embryos after thawing by morphological analysis, gene expression and in vitro development before and after cryopreservation. Cummulus-oocyte complexes were in vitro matured, fertilized and cultured. Expanded blastocysts (n= 600) harvested on days 7-9 were submitted controlled freezing [controlled group: 10% ethylene glycol (EG) for 10 minutes and 1.2oC per minute cryopreservation], quick-freezing [quick group: 10% EG for 10 minutes, 20% EG + 20% Glycerol (Gly) for 30 seconds] or vitrification [vitrification group: 10% EG for 10 minutes, 25% EG + 25% Gly for 30 seconds] protocols. The embryos of the control group were not exposed to cryoprotectant or crypreservation method and the hatching rate was evaluated on day12 post-insemination. The straws (quick and vitrification groups) were first placed on nitrogen vapor (0.8 cm over the liquid nitrogen) for 2 minutes and than immersed in liquid nitrogen. Embryos were thawed in air for 10 seconds followed by 25oC water bath for 20 seconds. Embryos were rehydrated in PBS + 0.2% BSA + 0.3M sucrose for 3 minutes and PBS + 0.2% BSA for the same time. In order to evaluate development of frozen-thawed embryos they were cocultured on granulosa cells in TCM 199 or SOFaa for 4 days. Hatching rate of control group was 46.09%. Data was analyzed by PROC MIXED model of SAS Sistems for Windows®. Controlled group hatching rate was 44.65% ± 5.94 and 11.65% ± 3.37 for TCM 199 and in SOFaa, respectively. Embryos submitted to quick group did not hatch regardless of culture condition. Vitrification group showed hatching rates of 9.43% ± 6.77 and 8.67% ± 4.47, respectively, in TCM 199 and SOFaa., and values were significant at p<0.05. The controlled group showed difference between the other groups of cryopreservation in both medium (TCM 199 and SOFaa). However, TCM 199 showed high rates of re-expansion and hatching. To gene expression analysis, 2 pools of 10 expanded blastocysts of fresh and cryopreserved embryos (controlled freezing) was used to RNA extraction, Reverse Transcription PCR (RT-PCR) was done and submitted to a Real Time PCR. The results of the Real Time PCR showed that the amount of material was not enough to the amplification of products in all reactions. In conclusion, the culture medium influences the embryo development after the cryopreservation being TCM199 more appropriate than SOFaa. And more number of expanded blastocysts is necessary to analysis the gene expression in a Real Time PCR reaction.

A ineficiência dos protocolos de criopreservação limita o uso em larga escala da produção in vitro de embriões bovinos. O objetivo deste trabalho foi identificar os danos causados pela criopreservação e pelo cultivo embrionário de embriões bovinos produzidos in vitro após a descongelação, avaliando a morfologia, a expressão gênica e o desenvolvimento in vitro antes e após a criopreservação. Complexos cummulusoócitos foram maturados, fecundados e cultivados in vitro. Blastocistos expandidos (n=600) obtidos entre os dias 7 e 9 de cultivo (fecundação D0) foram submetidos a congelação controlada (grupo controlado: 10% de etileno glicol (EG) por 10 minutos, 1,2oC por minuto), congelação rápida (grupo rápido: 10% de EG por 10 minutos , 20% de EG + 20% de Glicerol (Gli) por 30 segundos) ou vitrificação (grupo vitrificação: 10% de EG por 10 minutos, 25% EG + 25% Gli por 30 segundos). Os embriões do grupo controle não foram expostos a crioprotetores e nem a protocolos de criopreservação, sendo avaliado o índice de eclosão 12 dias após a fecundação (46,09%). As palhetas para os protocolos de congelação rápida e vitrificação foram mantidas em vapor de nitrogênio líquido (0,8cm sobre o líquido) por 2 minutos e imersas no nitrogênio líquido. Os embriões foram descongelados por 10 segundos em ar e 20 segundos em banhomaria a 25oC. Os embriões foram reidratados em solução de PBS + 0,2% de BSA + 0,3M de sacarose e em solução de PBS + 0,2% de BSA ambos por 3 minutos. Para avaliar o desenvolvimento, os embriões, após a descongelação, foram co-cultivados com células da granulosa em meio TCM199 ou SOFaa por 4 dias. Os dados foram analisados com o aplicativo PROC MIXED do programa SAS Sistems for Windows®. O grupo controlado apresentou índices de eclosão de 44,65% ± 5,94 e 11,65 ± 3,37 para o meio TCM199 e para o meio SOFaa, respectivamente. Embriões do grupo rápido não apresentaram eclosão, independente do meio de cultivo. O grupo vitrificação apresentou índices de eclosão de 9,43% ± 6,77 e 8,67% ± 4,47, respectivamente, em meio TCM199 e SOFaa. Os valores foram significativos quando p<0,05. O grupo controlado apresentou diferença em relação aos outros grupos em ambos os meios de cultivo. No meio TCM199 os índices de re-expansão e eclosão foram mais altos. Para a análise da expressão gênica, 2 pools de 10 blastocistos expandidos de embriões frescos e criopreservados (congelação controlada) foram utilizados para a extração de RNA. Foi feita reação de Transcrição Reversa (RT-PCR) e de PCR em Tempo Real. Os resultados da reação de PCR em Tempo Real demonstraram que a quantidade de material não foi suficiente para a amplificação de produtos em todas as reações. Concluindo, o meio de cultivo TCM199 exerce influência sobre o desenvolvimento embrionário após a criopreservação, sendo mais apropriado do que o meio SOFaa. E, para proceder a análise da expressão gênica pela reação de PCR em Tempo Real é necessário número maior de blastocistos expandidos. / The inefficiency of embryo cryopreservation protocols limits the broad use of in vitro production (IVP) of bovine embryos. The aim of this work was to identify the damage caused by cryopreservation and embryo culture of in vitro produced bovine embryos after thawing by morphological analysis, gene expression and in vitro development before and after cryopreservation. Cummulus-oocyte complexes were in vitro matured, fertilized and cultured. Expanded blastocysts (n= 600) harvested on days 7-9 were submitted controlled freezing [controlled group: 10% ethylene glycol (EG) for 10 minutes and 1.2oC per minute cryopreservation], quick-freezing [quick group: 10% EG for 10 minutes, 20% EG + 20% Glycerol (Gly) for 30 seconds] or vitrification [vitrification group: 10% EG for 10 minutes, 25% EG + 25% Gly for 30 seconds] protocols. The embryos of the control group were not exposed to cryoprotectant or crypreservation method and the hatching rate was evaluated on day12 post-insemination. The straws (quick and vitrification groups) were first placed on nitrogen vapor (0.8 cm over the liquid nitrogen) for 2 minutes and than immersed in liquid nitrogen. Embryos were thawed in air for 10 seconds followed by 25oC water bath for 20 seconds. Embryos were rehydrated in PBS + 0.2% BSA + 0.3M sucrose for 3 minutes and PBS + 0.2% BSA for the same time. In order to evaluate development of frozen-thawed embryos they were cocultured on granulosa cells in TCM 199 or SOFaa for 4 days. Hatching rate of control group was 46.09%. Data was analyzed by PROC MIXED model of SAS Sistems for Windows®. Controlled group hatching rate was 44.65% ± 5.94 and 11.65% ± 3.37 for TCM 199 and in SOFaa, respectively. Embryos submitted to quick group did not hatch regardless of culture condition. Vitrification group showed hatching rates of 9.43% ± 6.77 and 8.67% ± 4.47, respectively, in TCM 199 and SOFaa., and values were significant at p<0.05. The controlled group showed difference between the other groups of cryopreservation in both medium (TCM 199 and SOFaa). However, TCM 199 showed high rates of re-expansion and hatching. To gene expression analysis, 2 pools of 10 expanded blastocysts of fresh and cryopreserved embryos (controlled freezing) was used to RNA extraction, Reverse Transcription PCR (RT-PCR) was done and submitted to a Real Time PCR. The results of the Real Time PCR showed that the amount of material was not enough to the amplification of products in all reactions. In conclusion, the culture medium influences the embryo development after the cryopreservation being TCM199 more appropriate than SOFaa. And more number of expanded blastocysts is necessary to analysis the gene expression in a Real Time PCR reaction.

Orientador: Fernanda da Cruz Landim-Alvarenga / Resumo: As tecnologias de reprodução assistida, tais como a fertilização in vitro (FIV), transferência de embriões, transgenia e clonagem, ainda não tem o impacto comercial desejado devido a baixa produção embrionária. Apenas 30 a 40% dos blastocistos desenvolvidos são obtidos de oócitos após a MIV, fertilização e cultivo dos embriões, embora 80% dos oócitos maturados in vitro sejam fertilizados com sucesso. O soro fetal bovino (SFB) é o suplemento mais utilizado no cultivo de embriões in vitro, uma vez que melhora o desenvolvimento dos blastocistos. Apesar disso, sua presença está relacionada a alterações do metabolismo embrionário, perda de qualidade e indução de modificações na expressão de vários genes embrionários. Na tentativa de minimizar os efeitos deletérios do SFB, várias citocinas e fatores de crescimento têm sido acrescentados aos meios de cultivo embrionários in vitro, com a intenção de mimetizar as condições de cultivo in vivo. O presente experimento tem como objetivo avaliar e comparar os efeitos da adição do SFB e de meio condicionado por células mesenquimais estromais (MSCs) durante o cultivo embrionário. Os parâmetros analisados foram a viabilidade embrionária, apoptose e o perfil transcricional de genes relacionados à qualidade dos embriões. Não foi observado uma diferença (P≥0,05) na clivagem dos blastocistos, porém observou-se que a taxa de produção de embriões utilizando SFB no CIV foi maior (P≤0,05) quando comparada com MC, mas não diferiu (P≥0,05) do grupo pro... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Endometrial mesenchymal stromal cell (eMSCs) secretes bioactive molecules such as cytokines and growth factors which are released as soluble factors or through extracellular vesicles (EVs). Conditioned medium (CM) of the MSCs maintains the immunomodulation and regenerative potential properties of the cells that produced it. This study investigated the use of CM by eMSC plus BSA as alternative to FBS in embryo culture medium. The developmental ability and quality of bovine embryos were determined by assessing their cell number and gene expression. The percentage of embryos that underwent cleavage was similar (P>0.05) among the groups but blastocyst formation was higher (P<0.05) in FBS group. The total cell number was higher in CM group, but not statistically different from the others (P>0.05). The relative mRNA expression of ELOVL6 was higher in the CM group, CASP3 in the BSA group, ACSL3 and VEGF in the FBS group. Taken together, these data suggest that CM can be used as an alternative supplement to FBS. We observed a different gene expression profile, suggesting the CM inhibited an increase in the relative mRNA levels for CASP3. Moreover, the CM favored the total number cells, inhibited the percentage of cells in apoptosis and produces better quality embryo. / Mestre

Experimentos anteriores realizados em nosso laboratório indicam que o sucesso gestacional é afetado pela poluição atmosférica. O presente estudo teve como objetivo avaliar os efeitos biológicos associados a uma curva dose resposta das partículas de exaustão do diesel (PED) sobre o desenvolvimento embrionário inicial e o potencial de implantação, utilizando-se como modelo a fertilização in vitro e o cultivo embrionário de camundongos. No Experimento 1, encontrou-se um efeito negativo dose-dependente sobre o desenvolvimento embrionário inicial, o processo de eclosão, a alocação das células e a morfologia da massa celular interna (MCI) dos blastocistos. A análise post-hoc revelou que o desenvolvimento precoce do embrião não foi afetado pelas concentrações de 0,2 µg/cm2 ou 2 µg/cm2, mas foi significativamente afetado pela concentração de 20 µg/cm2 de PED. O processo de eclosão foi prejudicado pelas concentrações de 2 µg/cm2 e 20 µg/cm2. A alocação das células da MCI e a relação entre as células da MCI e do trofectoderma foram significativamente afetadas por todas as concentrações. Adicionalmente, observou-se um efeito negativo sobre a morfologia da MCI para as concentrações de 2 µg/cm2 e 20 µg/cm2. O Experimento 2, apesar de não mostrar efeito significativo sobre o potencial de implantação, evidenciado pela capacidade de adesão dos blastocistos e crescimento trofoblástico, revelou que a morfologia da MCI no dia 8 de cultivo, as taxas de viabilidade e de apoptose celular e a expressão de Oct4 e Cdx2 foram significativamente afetadas. O teste HSD-Tukey demonstrou que a presença de PED (0,2 µg/cm2 e 2 µg/cm2) durante o desenvolvimento embrionário aumentou significativamente a taxa de células em apoptose dos embriões tanto no dia 5 quanto no dia 8 de cultivo e, embora a proporção de células viáveis no dia 8 tenha sido prejudicada por ambas as concentrações, apenas a exposição a 2 µg/cm2 de PED diminuiu a viabilidade celular no dia 5. Por outro lado, tanto a concentração de 0,2 µg/cm2 como a de 2 µg/cm2 tiveram um efeito negativo significativo sobre a qualidade da MCI no dia 8 e a taxa de expressão de Oct4 nos blastocistos e aumentaram a porcentagem de células desses blastocistos expressando Cdx2, adicionalmente, a razão Oct4/Cdx2 dos embriões expostos a 0,2 µg/cm2 e 2 µg/cm2 foi significativamente menor. Frente a esses resultados, presumi-se que as PED poderiam estar envolvidas nos mecanismos que levariam à diminuição do sucesso reprodutivo observado em camundongos expostos à poluição atmosférica ambiental / Previous experiments conducted in our laboratory demonstrate that successful pregnancy is affected by air pollution. The aim of this study was to evaluate the biological effects associated with a dose-response curve of the diesel exhaust particles (DEP) on early embryonic development and implantation potential, using mice in vitro fertilization and culture embryo as model. In Experiment 1, we found a negative dose-dependent effect on the embryonic development, hatching process, cell allocation and morphology of inner cell mass (ICM) of blastocysts. A post-hoc analysis revealed that the early development of the embryo was not affected by concentrations of 0.2 g/cm2 or 2g/cm2, but was significantly affected by the concentration of 20 g/cm2 of DEP. The hatching process was impaired by concentrations of 2 g/cm2 and 20 g/cm2. Cell allocation of ICM and the ratio between cells of ICM and trophectoderm were significantly affected by all concentrations. Addicionaly, we observed a negative effect on ICM morphology was observed for the 2 µg/cm2 and the 20 µg/cm2 concentrations. Experiment 2, despite showing no significant effect on implantation potential, as evidenced by the adhesion ability and trophoblast outgrowth, revealed that ICM morphology on day 8 of culture, rates of cell viability and apoptosis, and expression of Oct4 and Cdx2 were significantly affected. The Tukey HSD test showed that presence of DEP (0.2 g/cm2 and 2 g/cm2) during embryonic development increased significantly the rate of apoptotic cells in embryos as on day 5 as on day 8 of culture, although the proportion of viable cells on day 8 was impaired by both concentrations, only exposure to 2 g/cm2 PED decreased cell viability on day 5. On the other hand, both the concentration of 0.2 g/cm2 such as 2 g/cm2 had a significant negative effect on the quality of ICM on the day 8 and the rate of expression of Oct4 on blastocysts, and increased the percentage of cells from these embryos expressing Cdx2, also, Oct4/Cdx2 ratio were significantly lower in the blastocysts derived from embryos exposed to 0.2 g/cm2 and 2 g/cm2¬ concentrations. Given these results, the suggestion is that DEP could be involved in the mechanisms that lead to decreased reproductive success observed in mice exposed to environmental pollution

Experimentos anteriores realizados em nosso laboratório indicam que o sucesso gestacional é afetado pela poluição atmosférica. O presente estudo teve como objetivo avaliar os efeitos biológicos associados a uma curva dose resposta das partículas de exaustão do diesel (PED) sobre o desenvolvimento embrionário inicial e o potencial de implantação, utilizando-se como modelo a fertilização in vitro e o cultivo embrionário de camundongos. No Experimento 1, encontrou-se um efeito negativo dose-dependente sobre o desenvolvimento embrionário inicial, o processo de eclosão, a alocação das células e a morfologia da massa celular interna (MCI) dos blastocistos. A análise post-hoc revelou que o desenvolvimento precoce do embrião não foi afetado pelas concentrações de 0,2 µg/cm2 ou 2 µg/cm2, mas foi significativamente afetado pela concentração de 20 µg/cm2 de PED. O processo de eclosão foi prejudicado pelas concentrações de 2 µg/cm2 e 20 µg/cm2. A alocação das células da MCI e a relação entre as células da MCI e do trofectoderma foram significativamente afetadas por todas as concentrações. Adicionalmente, observou-se um efeito negativo sobre a morfologia da MCI para as concentrações de 2 µg/cm2 e 20 µg/cm2. O Experimento 2, apesar de não mostrar efeito significativo sobre o potencial de implantação, evidenciado pela capacidade de adesão dos blastocistos e crescimento trofoblástico, revelou que a morfologia da MCI no dia 8 de cultivo, as taxas de viabilidade e de apoptose celular e a expressão de Oct4 e Cdx2 foram significativamente afetadas. O teste HSD-Tukey demonstrou que a presença de PED (0,2 µg/cm2 e 2 µg/cm2) durante o desenvolvimento embrionário aumentou significativamente a taxa de células em apoptose dos embriões tanto no dia 5 quanto no dia 8 de cultivo e, embora a proporção de células viáveis no dia 8 tenha sido prejudicada por ambas as concentrações, apenas a exposição a 2 µg/cm2 de PED diminuiu a viabilidade celular no dia 5. Por outro lado, tanto a concentração de 0,2 µg/cm2 como a de 2 µg/cm2 tiveram um efeito negativo significativo sobre a qualidade da MCI no dia 8 e a taxa de expressão de Oct4 nos blastocistos e aumentaram a porcentagem de células desses blastocistos expressando Cdx2, adicionalmente, a razão Oct4/Cdx2 dos embriões expostos a 0,2 µg/cm2 e 2 µg/cm2 foi significativamente menor. Frente a esses resultados, presumi-se que as PED poderiam estar envolvidas nos mecanismos que levariam à diminuição do sucesso reprodutivo observado em camundongos expostos à poluição atmosférica ambiental / Previous experiments conducted in our laboratory demonstrate that successful pregnancy is affected by air pollution. The aim of this study was to evaluate the biological effects associated with a dose-response curve of the diesel exhaust particles (DEP) on early embryonic development and implantation potential, using mice in vitro fertilization and culture embryo as model. In Experiment 1, we found a negative dose-dependent effect on the embryonic development, hatching process, cell allocation and morphology of inner cell mass (ICM) of blastocysts. A post-hoc analysis revealed that the early development of the embryo was not affected by concentrations of 0.2 g/cm2 or 2g/cm2, but was significantly affected by the concentration of 20 g/cm2 of DEP. The hatching process was impaired by concentrations of 2 g/cm2 and 20 g/cm2. Cell allocation of ICM and the ratio between cells of ICM and trophectoderm were significantly affected by all concentrations. Addicionaly, we observed a negative effect on ICM morphology was observed for the 2 µg/cm2 and the 20 µg/cm2 concentrations. Experiment 2, despite showing no significant effect on implantation potential, as evidenced by the adhesion ability and trophoblast outgrowth, revealed that ICM morphology on day 8 of culture, rates of cell viability and apoptosis, and expression of Oct4 and Cdx2 were significantly affected. The Tukey HSD test showed that presence of DEP (0.2 g/cm2 and 2 g/cm2) during embryonic development increased significantly the rate of apoptotic cells in embryos as on day 5 as on day 8 of culture, although the proportion of viable cells on day 8 was impaired by both concentrations, only exposure to 2 g/cm2 PED decreased cell viability on day 5. On the other hand, both the concentration of 0.2 g/cm2 such as 2 g/cm2 had a significant negative effect on the quality of ICM on the day 8 and the rate of expression of Oct4 on blastocysts, and increased the percentage of cells from these embryos expressing Cdx2, also, Oct4/Cdx2 ratio were significantly lower in the blastocysts derived from embryos exposed to 0.2 g/cm2 and 2 g/cm2¬ concentrations. Given these results, the suggestion is that DEP could be involved in the mechanisms that lead to decreased reproductive success observed in mice exposed to environmental pollution