Submitted by Socorro Pontes (socorrop@ufersa.edu.br) on 2017-03-22T14:51:38Z No. of bitstreams: 1 AlanaAB_DISSERT.pdf: 4740716 bytes, checksum: e3666ea7a25906742164df387e99208b (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-22T14:51:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 AlanaAB_DISSERT.pdf: 4740716 bytes, checksum: e3666ea7a25906742164df387e99208b (MD5) Previous issue date: 2016-11-01 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The cryopreservation of somatic tissue derived from collared peccaries represents an interesting step in the obtainment and conservation of cells for nuclear transfer (cloning). In this sense, tissue vitrification protocols need to be optimized to ensure maximum preservation of viable cell characteristics. Therefore, the aims of this study were to characterize histologically the peripheral auricular integumentary system (Stage 1) and evaluate different cryoprotectants in the solid-surface vitrification of somatic tissue of collared peccaries (Stage 2). Thun, ear fragments (9.0 mm3) were collected of sixteen animals derived from the Multiplication Center of Wild Animals (CEMAS/UFERSA). In the first stage, tissue samples were evaluated for the characterization of layers, its components and proliferative activity. For the second stage, tissue fragments were cryopreserved by solidsurface vitrification using Dulbecco modified minimum essential medium supplemented with 10% fetal bovine serum and different cryoprotectants and concentrations [dimethylsulfoxide (DMSO, 3.0 M), ethylene glycol (EG; 3.0 M) and association DMSO/EG (1.5 M; 1.5 M) in the absence and presence of sucrose (0.25M)]. After two weeks, warmed and non-vitrified (control) fragments were analyzed using histological techniques. Thus, for both steps, tissue samples were evaluated using hematoxylin-eosin and Gomori Trichrome, quantification of regions argyrophilic nucleolar organizer (AgNORs) and viability by MTT assay (3-[4,5- dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide). Also, in the first stage, fragments were analyzed by transmission electronic microscopy. Thus, in the first stage, sizes of 104.2 μm and 222.6 μm were observed in the epidermis and dermis, with a volumetric ratio of 36.6% and 58.7%, respectively. Moreover, in the epidermis were evidenced the basal layer (22.5 μm), intermediate (53.5 μm) and cornea (28.2 μm), with mean values of 65.3 epithelial cells, 43.4 melanocytes and 14.8 perinuclear halos. Already the dermis has 127 fibroblasts with 2.5 AgNORs by nucleolus. Additionally, the metabolic activity was 0.243. In the second stage, the 3.0 M EG with sucrose was able to maintain normal tissue characteristics compared with non-vitrified (control), especially for the volumetric ratio of epidermis (61.2 vs. 58.7) and dermis (34.5 vs. 36.6), number of fibroblast (90.3 vs. 127.0), and AgNOR ratio (0.09 vs. 0.17), respectively. In conclusion, the peripheral auricular integumentary system derived from collared peccaries possessed some variations compared to other mammals, as the number of layers and thickness of the epidermis, number of epithelial cells, melanocytes and proliferative parameters. Moreover, 3.0 M EG with 0.25 M sucrose resulted in a better cryoprotectant composition in the vitritification for somatic tissue of collared peccaries / A criopreservação de tecido somático de catetos representa uma etapa interessante na obtenção e conservação de células para a transferência nuclear (clonagem). Nesse sentido, protocolos de vitrificação tecidual necessitam ser otimizados para garantir a máxima conservação das características viáveis das células. Portanto, os objetivos do presente trabalho foram caracterizar histologicamente o sistema tegumentar da região auricular periférica (Etapa 1) e avaliar diferentes crioprotetores na vitrificação em superfície sólida de tecido somático de catetos (Etapa 2). Para tanto, fragmentos auriculares (9,0 mm3) foram recuperados de dezesseis animais oriundos do Centro de Multiplicação de Animais Silvestres (CEMAS/UFERSA). Na primeira etapa, amostras teciduais foram avaliadas quanto à caracterização das camadas, seus componentes e atividade proliferativa. Para a segunda etapa, fragmentos teciduais foram criopreservados por vitrificação em superfície sólida em meio essencial mínimo modificado por Dulbecco suplementado com 10% de soro fetal bovino e diferentes crioprotetores e concentrações [dimetilsulfóxido (DMSO; 3,0 M), etilenoglicol (EG; 3,0 M) e associação DMSO/EG (1,5 M; 1,5 M) na ausência e presença de sacarose (0,25 M)]. Após duas semanas, fragmentos aquecidos e não criopreservados (controle) foram analisados usando técnicas histológicas. Assim, para ambas as etapas, amostras teciduais foram avaliadas usando colorações hematoxilina-eosina e tricômico de Gomori, quantificação de regiões argirofílicas organizadoras nucleolares (AgNORs) e viabilidade pelo ensaio de MTT (brometo de 3-[4,5-dimetil-tiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazólio). Ainda, na primeira etapa, fragmentos foram analisados por microscopia eletrônica de transmissão. Assim, na primeira etapa, tamanhos de 104,2 μm e 222,6 μm foram observados para epiderme e derme, com uma proporção volumétrica de 36,6% e 58,7%, respectivamente. Além disso, na epiderme, foram evidenciadas as camadas basal (22,5 μm), intermediárias (53,5 μm) e córnea (28,2 μm), com valores médios de 65,3 de células epidermais, 43,4 melanócitos e 14,8 de halos perinucleares. Já a derme apresentou 127 fibroblastos com 2,5 AgNORs por nucléolo. Adicionalmente, a atividade metabólica foi de 0,243. Na segunda etapa, a combinação de 3,0 M de EG com sacarose foi adequada em manter as características teciduais normais quando comparado com os fragmentos não vitrificados, especialmente para a proporção volumétrica da epiderme (61,2 vs. 58,7) e derme (34,5 vs. 36,6), número de fibroblastos (90,3 vs. 127,0) e razão de AgNOR (0,09 vs. 0,17), respectivamente. Em conclusão, o sistema tegumentar auricular periférico de catetos possuiu algumas variações em relação a outros mamíferos, quanto ao número de camadas e espessura da epiderme, quantidade de células epidermais, melanócitos e parâmetros proliferativos. Além disso, 3,0 M de EG com 0,25 M de sacarose resultaram na melhor composição de crioprotetores na vitrificação de tecido somático de catetos / 2017-03-21

Submitted by Socorro Pontes (socorrop@ufersa.edu.br) on 2017-03-07T12:56:11Z No. of bitstreams: 1 MagdaLTS_DISSERT.pdf: 1454861 bytes, checksum: 4612469437c8dd924c24af03a052758d (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-07T12:56:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 MagdaLTS_DISSERT.pdf: 1454861 bytes, checksum: 4612469437c8dd924c24af03a052758d (MD5) Previous issue date: 2016-03-30 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The maintenance of metabolic activities during the in vitro culture of somatic cells of wild animals, especially collared peccary (Pecari tajacu), is an interesting step in the conservation of these cells for use in nuclear transfer (cloning). In this context, it is necessary to optimize the in vitro culture conditions of somatic cell by establishment of some appropriate supplementations to the media, in order to ensure the maximum preservation of the viable cell characteristics. Therefore, this study aimed to optimize the composition of the culture means of somatic cell derived from ear tissue of collared peccaries, evaluating two concentrations of fetal bovine serum (E1: FBS; 10% vs. 20%) and epidermal growth factor (E2: EGF, 5 ng/mL vs. 10 ng/mL). Thus, tissue fragments from 18 adult animals were submitted to primary culture and subcultures for 40 days until the fourth passage and the resulting cells were analyzed for morphology, adhesion, subconfluence, proliferative activity for developing growth curve for seven days and determining the population doubling time (PDT), viability by trypan blue and functional/metabolic activity by assay 3-[4,5-dimethyl-thiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT). Moreover, in the E1, comparisons as cell adhesion were performed with cells cultured in the presence of bovine serum albumin (BSA, 0.5% and 1.0%). All data were analyzed by ANOVA followed by post hoc test. In the E1, no difference (P>0.05) was observed between the concentrations of FBS for the number of adhered [SFB10: 39/39 vs. SB20: 35/39] and subconfluent fragments [SFB10: 39/39 vs. SB20: 35/39], day all adhered [SFB10: 3.5 vs. SFB20: 3.0], with growth [SFB10: 7.4 vs. SFB20: 7.2] and subconfluent samples [SFB10: 11.8 vs. SFB20: 11.8]. However, significant values were observed in cells cultured in the presence of 20% FBS for viability [SFB10: 85.6% vs. SFB20: 98.2%], PDT [SFB10: 155.4 h vs.77.25 h] and MTT assay [SFB10: 0.57-0.57 vs. SFB20: 0.82-0.99 (D5-D7)]. Additionally, comparisons of supplementation of BSA and FBS confirm the potential FBS cell adhesion. Thus, 20% FBS was used in the following experiment. In the evaluation of the presence of EGF in culture, no difference was observed in the evaluated parameters for the number of attached [EGF0: 31/31 vs. EGF5: 31/31 vs. EGF10: 31/31] and subconfluent fragments [EGF0: 31/31 vs. EGF5: 31/31 vs. EGF10: 31/31] day all adhered [EGF0: 4.9 vs. EGF5: 7.0 vs. EGF10: 3.5] growth [EGF0: 7.2 vs. EGF5: 8.2 vs. EGF10: 7.9] and subconfluent samples [0 EGF: 12.6 vs. EGF5: 16.6 vs. EGF10:12.6], viability [EGF0: 84.3% vs. EGF5: 88.8% vs. EGF10: 87.0%], PDT [EGF0: 69.6 h vs. EGF5: 64.8 h vs. EGF10: 65.3 h] and MTT assay [EGF0: 1.26-1.38 vs. EGF5: 1.06-1.14 vs. EGF10: 1.13-1.16 (D5-D7)]. In all experiments, the growth curves showed clear log and lag phases of development. In conclusion, 20% FBS is suitable for the recovery of somatic cells in vitro; however, EGF does not improve the quality of growing these cells / A manutenção das atividades metabólicas durante o cultivo in vitro de células somáticas de animais silvestres, especialmente catetos (Pecari tajacu), representa uma etapa interessante na conservação dessas células para aplicação na transferência nuclear (clonagem). Nesse contexto, faz-se necessário a otimização das condições de cultivo in vitro de células somáticas pelo estabelecimento de algumas suplementações adequadas aos meios, visando garantir a máxima preservação das características celulares viáveis. Portanto, o presente trabalho teve como objetivo otimizar a composição do meio de cultivo de células somáticas derivadas de tecido auricular de catetos, avaliando duas concentrações de soro fetal bovino (E1: SFB; 10% vs. 20%) e fator de crescimento epidermal (E2: EGF; 5 ng/mL vs. 10 ng/mL). Para tanto, fragmentos teciduais de 18 animais adultos foram submetidos ao cultivo primário e subcultivos por 40 dias, até a quarta passagem e as células resultantes foram analisadas quanto à morfologia, aderência, subconfluência, atividade proliferativa pela elaboração de curva de crescimento por sete dias e determinação do tempo de duplicação da população (PDT), viabilidade por azul de tripano e atividade funcional/metabólica pelo ensaio de brometo de 3-[4,5-dimetil-tiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazólio (MTT). Além disso, no E1, comparações quanto à adesão celular foram realizadas com células cultivadas na presença de albumina sérica bovina (BSA, 0,5% e 1,0%). Todos os dados foram analisados por ANOVA seguido por teste post-hoc. No E1, nenhuma diferença (P>0,05) foi observada entre as concentrações de SFB para o número de fragmentos aderidos [SFB10: 39/39 vs. SB20: 35/39] e subconfluentes [SFB10: 39/39 vs. SB20: 35/39], dia de todas as amostras aderidas [SFB10: 3,5 vs. SFB20: 3,0], com crescimento [SFB10: 7,4 vs. SFB20: 7,2] e subconfluentes [SFB10: 11,8 vs. SFB20: 11,8]. Contudo, valores significativos foram observados em células cultivadas na presença de SFB a 20% quanto à viabilidade [SFB10: 85,6% vs. SFB20: 98,2%], PDT [SFB10: 155,4 h vs.77,2 h] e ensaio de MTT [SFB10: 0,57-0,57 vs. SFB20: 0,82-0,99 (D5-D7)]. Adicionalmente, comparações da suplementação do BSA e SFB confirmaram o potencial de adesão celular do soro. Assim, SFB a 20% foi empregado no experimento seguinte. Já na avaliação da presença de EGF no cultivo, nenhuma diferença foi observada nos parâmetros avaliados para o número de fragmentos aderidos [EGF0: 31/31 vs. EGF5: 31/31 vs. EGF10: 31/31] e subconfluentes [EGF0: 31/31 vs. EGF5: 31/31 vs. EGF10: 31/31], dia de todas as amostras aderidas [EGF0: 4,9 vs. EGF5: 7,0 vs. EGF10: 3,5], em crescimento [EGF0: 7,2 vs. EGF5: 8,2 vs. EGF10: 7,9] e subconfluentes [EGF0: 12,6 vs. EGF5: 16,6 vs. EGF10: 12,6], viabilidade [EGF0: 84,3% vs. EGF5: 88,8% vs. EGF10: 87,0%], PDT [EGF0: 69,6 h vs. EGF5: 64,8 h vs. EGF10: 65,3 h] e ensaio de MTT [EGF0: 1,26-1,38 vs. EGF5: 1,06-1,14 vs. EGF10: 1,13-1,16 (D5-D7)]. Em todos os experimentos, as curvas de crescimento apresentaram nítidas fases log e lag de desenvolvimento. Em conclusão, o SFB a 20% é adequado para a recuperação de células somáticas in vitro; contudo, o EGF não melhora a qualidade do cultivo dessas células / 2017-03-07