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Previous issue date: 2016-11-01 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The cryopreservation of somatic tissue derived from collared peccaries
represents an interesting step in the obtainment and conservation of cells for nuclear transfer
(cloning). In this sense, tissue vitrification protocols need to be optimized to ensure maximum
preservation of viable cell characteristics. Therefore, the aims of this study were to
characterize histologically the peripheral auricular integumentary system (Stage 1) and
evaluate different cryoprotectants in the solid-surface vitrification of somatic tissue of
collared peccaries (Stage 2). Thun, ear fragments (9.0 mm3) were collected of sixteen animals
derived from the Multiplication Center of Wild Animals (CEMAS/UFERSA). In the first
stage, tissue samples were evaluated for the characterization of layers, its components and
proliferative activity. For the second stage, tissue fragments were cryopreserved by solidsurface
vitrification using Dulbecco modified minimum essential medium supplemented with
10% fetal bovine serum and different cryoprotectants and concentrations [dimethylsulfoxide
(DMSO, 3.0 M), ethylene glycol (EG; 3.0 M) and association DMSO/EG (1.5 M; 1.5 M) in
the absence and presence of sucrose (0.25M)]. After two weeks, warmed and non-vitrified
(control) fragments were analyzed using histological techniques. Thus, for both steps, tissue
samples were evaluated using hematoxylin-eosin and Gomori Trichrome, quantification of
regions argyrophilic nucleolar organizer (AgNORs) and viability by MTT assay (3-[4,5-
dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide). Also, in the first stage, fragments
were analyzed by transmission electronic microscopy. Thus, in the first stage, sizes of 104.2
μm and 222.6 μm were observed in the epidermis and dermis, with a volumetric ratio of
36.6% and 58.7%, respectively. Moreover, in the epidermis were evidenced the basal layer
(22.5 μm), intermediate (53.5 μm) and cornea (28.2 μm), with mean values of 65.3 epithelial
cells, 43.4 melanocytes and 14.8 perinuclear halos. Already the dermis has 127 fibroblasts
with 2.5 AgNORs by nucleolus. Additionally, the metabolic activity was 0.243. In the second
stage, the 3.0 M EG with sucrose was able to maintain normal tissue characteristics compared
with non-vitrified (control), especially for the volumetric ratio of epidermis (61.2 vs. 58.7)
and dermis (34.5 vs. 36.6), number of fibroblast (90.3 vs. 127.0), and AgNOR ratio (0.09 vs.
0.17), respectively. In conclusion, the peripheral auricular integumentary system derived from
collared peccaries possessed some variations compared to other mammals, as the number of
layers and thickness of the epidermis, number of epithelial cells, melanocytes and
proliferative parameters. Moreover, 3.0 M EG with 0.25 M sucrose resulted in a better
cryoprotectant composition in the vitritification for somatic tissue of collared peccaries / A criopreservação de tecido somático de catetos representa uma etapa
interessante na obtenção e conservação de células para a transferência nuclear (clonagem).
Nesse sentido, protocolos de vitrificação tecidual necessitam ser otimizados para garantir a
máxima conservação das características viáveis das células. Portanto, os objetivos do presente
trabalho foram caracterizar histologicamente o sistema tegumentar da região auricular
periférica (Etapa 1) e avaliar diferentes crioprotetores na vitrificação em superfície sólida de
tecido somático de catetos (Etapa 2). Para tanto, fragmentos auriculares (9,0 mm3) foram
recuperados de dezesseis animais oriundos do Centro de Multiplicação de Animais Silvestres
(CEMAS/UFERSA). Na primeira etapa, amostras teciduais foram avaliadas quanto à
caracterização das camadas, seus componentes e atividade proliferativa. Para a segunda etapa,
fragmentos teciduais foram criopreservados por vitrificação em superfície sólida em meio
essencial mínimo modificado por Dulbecco suplementado com 10% de soro fetal bovino e
diferentes crioprotetores e concentrações [dimetilsulfóxido (DMSO; 3,0 M), etilenoglicol
(EG; 3,0 M) e associação DMSO/EG (1,5 M; 1,5 M) na ausência e presença de sacarose (0,25
M)]. Após duas semanas, fragmentos aquecidos e não criopreservados (controle) foram
analisados usando técnicas histológicas. Assim, para ambas as etapas, amostras teciduais
foram avaliadas usando colorações hematoxilina-eosina e tricômico de Gomori, quantificação
de regiões argirofílicas organizadoras nucleolares (AgNORs) e viabilidade pelo ensaio de
MTT (brometo de 3-[4,5-dimetil-tiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazólio). Ainda, na primeira etapa,
fragmentos foram analisados por microscopia eletrônica de transmissão. Assim, na primeira
etapa, tamanhos de 104,2 μm e 222,6 μm foram observados para epiderme e derme, com uma
proporção volumétrica de 36,6% e 58,7%, respectivamente. Além disso, na epiderme, foram
evidenciadas as camadas basal (22,5 μm), intermediárias (53,5 μm) e córnea (28,2 μm), com
valores médios de 65,3 de células epidermais, 43,4 melanócitos e 14,8 de halos perinucleares.
Já a derme apresentou 127 fibroblastos com 2,5 AgNORs por nucléolo. Adicionalmente, a
atividade metabólica foi de 0,243. Na segunda etapa, a combinação de 3,0 M de EG com
sacarose foi adequada em manter as características teciduais normais quando comparado com
os fragmentos não vitrificados, especialmente para a proporção volumétrica da epiderme (61,2
vs. 58,7) e derme (34,5 vs. 36,6), número de fibroblastos (90,3 vs. 127,0) e razão de AgNOR
(0,09 vs. 0,17), respectivamente. Em conclusão, o sistema tegumentar auricular periférico de
catetos possuiu algumas variações em relação a outros mamíferos, quanto ao número de
camadas e espessura da epiderme, quantidade de células epidermais, melanócitos e
parâmetros proliferativos. Além disso, 3,0 M de EG com 0,25 M de sacarose resultaram na
melhor composição de crioprotetores na vitrificação de tecido somático de catetos / 2017-03-21
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:bdtd.ufersa.edu.br:tede/633 |
| Date | 01 November 2016 |
| Creators | Borges, Alana Azevedo |
| Contributors | http://lattes.cnpq.br/8114638410593492, Pereira, Alexsandra Fernandes, Silva, Alexandre Rodrigues, Silva, Alexandre Rodrigues, Teixeira, Dárcio Ítalo Alves |
| Publisher | Universidade Federal Rural do Semi-Árido, Programa de Pós-graduação em Ciência Animal, UFERSA, Brasil |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFERSA, instname:Universidade Federal Rural do Semi-Árido, instacron:UFERSA |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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