Considerando a importância comercial da perdiz (Rhynchotus rufescens), implantou-se algumas biotecnologias reprodutivas. Trinta animais foram divididos aleatoriamente em dois grupos: controle (sem selênio orgânico) e tratamento (com 0,2 a 0,8mg de selênio em 1000kgs de ração ), provenientes da FCAV-UNESP/Jaboticabal (2007-2008). Coletou-se semên por excitação manual que foram aliquotados em pools com 150&micro;L. Após a avaliação do volume, motilidade, vigor, números de espermatozóides, concentração e morfologia espermática, diluiu-se 20&micro;l de sêmen em 300&micro;l de solução fisiológica para testar a Integridade das membranas acrossomal e plasmática e avaliação da atividade mitocondrial. Uma outra alíquota de 20&micro;l foi utilizada para testar a resistência dos espermatozóides ao estresse oxidativo, induzido (vitamina C + sulfato ferroso), por meio da dosagem de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS). A amostra restante foi congelada diretamente em nitrogênio líquido para a realização do teste da integridade do DNA espermático e para medir a atividade das enzimas antioxidantes Catalase e Glutationa Peroxidase. Contou-se 200 células, para avaliação da integridade acrossomal e de membrana, atividade mitocondrial e ensaio cometa e classificou-as: 1) Acrossomo Íntegro: cor lilás e Não-Íntegro: róseo; 2)Células Vivas (não coradas) e Mortas (coradas), 3) Classes de I a IV, sendo Classe I (todas as mitocôndrias íntegras) com a peça intermediária totalmente corada e Classe IV (todas as mitocôndrias comprometidas) com a peça intermediária totalmente descorada e 4) Cometa I a IV, sendo Cometa I (DNA íntegro): células com halo ao seu redor e núcleo corado, porém sem cauda de cometa evidente e Cometa IV (DNA altamente fragmentado): célula com núcleo completamente descorado e apenas a cauda do cometa, respevtivamente. Os dados foram analisados pelo SAS, System for Windows. Nenhuma diferença foi encontrada para volume, motilidade, vigor, número de espermatozóides, concentração, integridade acrossomal, integridade da membrana plasmática, Classes I e III da atividade mitocondrial, Cometa I,II e IV, TBARS e atividade da Glutationa. Foram encontradas diferenças nas Classes II (Se=33,39±2,93 e Controle=44,39±2,59, p=0.0125 e IV (Se=3,44±0,09 e Controle=1,50±0,38, p=0.0401) e Cometa III (Se=16,00 ± 0,82 e Controle=34,75 ± 1,44, p=<.0001), respectivamente. A diferença encontrada no DAB II pode ser devido aos danos causados na arquitetura da peça intermediária pela deficiência de selênio, o que compromete a mobilidade e a capacidade de fecundação do espermatozóide. Para o DAB IV, não era esperado esse resultado, que pode ser devido aos pequenos valores encontrados para essa variável (Se=3,44% e Controle=1,50%) em relação ao total das classes e que poderia não ser significante se levássemos em consideração as classes juntas. Em relação a porcentagem mais baixa de espermatozóides do grupo suplementado com selênio para a classe III do Ensaio Cometa, pode sugerir um efeito de proteção desta substância, possivelmente devido a um índice mais elevado da Glutationa Peroxidase. / Considering the commercial value of the partridges (Rhynchotus rufescens), the employment of reproductive biotechnologies has been attempted. Thirty animals were randomly assigned into two groups: control group (no selenium) and treatment group (supplemented with 0,2 a 0,8mg selenium/ 1000kgs ration). Animals were allocated at the FCAV - UNESP/Jaboticabal (2007-2008). Semen collections were performed by digital manipulation and divided in pools of at least 150&micro;L. After the immediate evaluation of volume, motility, vigour, concentration and morphology, an aliquot of 20&micro;L was diluted in 300&micro;L of physiologic solution in order to test acrosome and membrane integrities and mitochondrial activity. Another aliquot of 20 &micro;L was used to test the resistance of sperm against the induced oxidative stress (Vitamin C + ferrous sulphate), followed by the measurement of TBARS. The remaining semen sample was frozen directly in liquid nitrogen in orther to perform the comet assay and to measure the activity of the antioxidant enzymes catalase and glutathione peroxidase. Cells were evaluated respectively for acrosome and membrane integrities, mitochondrial activity and comet assay as follows: 1) Intact acrosome: lilac acrosome; Non-intact acrosome: pink acrosome; 2) Live cells: non stained; Dead: stained; 3) Classes I to IV, being Class I (full mitochondrial potential): midpiece totally stained and class IV (no mitochondrial potential): midpiece not stained; 4) Classes I to IV, being Class I (intact DNA): nucleus with intense fluorescence with no comet tail; Class IV (highly fragmented DNA): no nucleus, only a comet tail. Data was statistically anlysed using the SAS System for Windows. No differences were found on volume, motility, vigour, number of spermatozoa, concentration, acrosomal and membrane integrity, Classes I and III of mitochondrial activity, Comets I, II and IV, TBARS and Glutathione activity. Differences were found on as DAB Classes II (Se=33.39±2.93 and control=44.39±2.59, p=0.0125) and IV (Se=3.44±0.09 and control=1.50±0.38, p=0.0401) and comet class III (Se=16.00 ± 0.82 and control=34.75 ± 1.44, p=<.0001), respectively. The difference found on DAB II may be due to the damages caused by the selenium deficiency to the architecture of the midpiece, which compromises sperm mobility and fertilization capacity. On the other hand, the unexpected difference found on DAB IV may be due to the small values found for this variable in all animals (Se=3.44% and control=1.50%), which would be not significant taking into account all classes. The decreased percentage of sperm showing DNA fragmentation Class II found on the selenium supplemented group may suggest a protective effect of this substance on sperm DNA, possibly due to a higher GPx content.

Considerando a importância comercial da perdiz (Rhynchotus rufescens), implantou-se algumas biotecnologias reprodutivas. Trinta animais foram divididos aleatoriamente em dois grupos: controle (sem selênio orgânico) e tratamento (com 0,2 a 0,8mg de selênio em 1000kgs de ração ), provenientes da FCAV-UNESP/Jaboticabal (2007-2008). Coletou-se semên por excitação manual que foram aliquotados em pools com 150&micro;L. Após a avaliação do volume, motilidade, vigor, números de espermatozóides, concentração e morfologia espermática, diluiu-se 20&micro;l de sêmen em 300&micro;l de solução fisiológica para testar a Integridade das membranas acrossomal e plasmática e avaliação da atividade mitocondrial. Uma outra alíquota de 20&micro;l foi utilizada para testar a resistência dos espermatozóides ao estresse oxidativo, induzido (vitamina C + sulfato ferroso), por meio da dosagem de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS). A amostra restante foi congelada diretamente em nitrogênio líquido para a realização do teste da integridade do DNA espermático e para medir a atividade das enzimas antioxidantes Catalase e Glutationa Peroxidase. Contou-se 200 células, para avaliação da integridade acrossomal e de membrana, atividade mitocondrial e ensaio cometa e classificou-as: 1) Acrossomo Íntegro: cor lilás e Não-Íntegro: róseo; 2)Células Vivas (não coradas) e Mortas (coradas), 3) Classes de I a IV, sendo Classe I (todas as mitocôndrias íntegras) com a peça intermediária totalmente corada e Classe IV (todas as mitocôndrias comprometidas) com a peça intermediária totalmente descorada e 4) Cometa I a IV, sendo Cometa I (DNA íntegro): células com halo ao seu redor e núcleo corado, porém sem cauda de cometa evidente e Cometa IV (DNA altamente fragmentado): célula com núcleo completamente descorado e apenas a cauda do cometa, respevtivamente. Os dados foram analisados pelo SAS, System for Windows. Nenhuma diferença foi encontrada para volume, motilidade, vigor, número de espermatozóides, concentração, integridade acrossomal, integridade da membrana plasmática, Classes I e III da atividade mitocondrial, Cometa I,II e IV, TBARS e atividade da Glutationa. Foram encontradas diferenças nas Classes II (Se=33,39±2,93 e Controle=44,39±2,59, p=0.0125 e IV (Se=3,44±0,09 e Controle=1,50±0,38, p=0.0401) e Cometa III (Se=16,00 ± 0,82 e Controle=34,75 ± 1,44, p=<.0001), respectivamente. A diferença encontrada no DAB II pode ser devido aos danos causados na arquitetura da peça intermediária pela deficiência de selênio, o que compromete a mobilidade e a capacidade de fecundação do espermatozóide. Para o DAB IV, não era esperado esse resultado, que pode ser devido aos pequenos valores encontrados para essa variável (Se=3,44% e Controle=1,50%) em relação ao total das classes e que poderia não ser significante se levássemos em consideração as classes juntas. Em relação a porcentagem mais baixa de espermatozóides do grupo suplementado com selênio para a classe III do Ensaio Cometa, pode sugerir um efeito de proteção desta substância, possivelmente devido a um índice mais elevado da Glutationa Peroxidase. / Considering the commercial value of the partridges (Rhynchotus rufescens), the employment of reproductive biotechnologies has been attempted. Thirty animals were randomly assigned into two groups: control group (no selenium) and treatment group (supplemented with 0,2 a 0,8mg selenium/ 1000kgs ration). Animals were allocated at the FCAV - UNESP/Jaboticabal (2007-2008). Semen collections were performed by digital manipulation and divided in pools of at least 150&micro;L. After the immediate evaluation of volume, motility, vigour, concentration and morphology, an aliquot of 20&micro;L was diluted in 300&micro;L of physiologic solution in order to test acrosome and membrane integrities and mitochondrial activity. Another aliquot of 20 &micro;L was used to test the resistance of sperm against the induced oxidative stress (Vitamin C + ferrous sulphate), followed by the measurement of TBARS. The remaining semen sample was frozen directly in liquid nitrogen in orther to perform the comet assay and to measure the activity of the antioxidant enzymes catalase and glutathione peroxidase. Cells were evaluated respectively for acrosome and membrane integrities, mitochondrial activity and comet assay as follows: 1) Intact acrosome: lilac acrosome; Non-intact acrosome: pink acrosome; 2) Live cells: non stained; Dead: stained; 3) Classes I to IV, being Class I (full mitochondrial potential): midpiece totally stained and class IV (no mitochondrial potential): midpiece not stained; 4) Classes I to IV, being Class I (intact DNA): nucleus with intense fluorescence with no comet tail; Class IV (highly fragmented DNA): no nucleus, only a comet tail. Data was statistically anlysed using the SAS System for Windows. No differences were found on volume, motility, vigour, number of spermatozoa, concentration, acrosomal and membrane integrity, Classes I and III of mitochondrial activity, Comets I, II and IV, TBARS and Glutathione activity. Differences were found on as DAB Classes II (Se=33.39±2.93 and control=44.39±2.59, p=0.0125) and IV (Se=3.44±0.09 and control=1.50±0.38, p=0.0401) and comet class III (Se=16.00 ± 0.82 and control=34.75 ± 1.44, p=<.0001), respectively. The difference found on DAB II may be due to the damages caused by the selenium deficiency to the architecture of the midpiece, which compromises sperm mobility and fertilization capacity. On the other hand, the unexpected difference found on DAB IV may be due to the small values found for this variable in all animals (Se=3.44% and control=1.50%), which would be not significant taking into account all classes. The decreased percentage of sperm showing DNA fragmentation Class II found on the selenium supplemented group may suggest a protective effect of this substance on sperm DNA, possibly due to a higher GPx content.

Foi conduzida uma série de experimentos onde se buscou definir: 1) o limite de tolerância do espermatozóide caprino a soluções hiperosmóticas de sacarose; 2) um diluente para criopreservação de sêmen que minimizasse as flutuações de volume celular. O limite de tolerância da membrana, avaliado pelo corante eosina-nigrosina, foi de 930 mOsm em soluções de sacarose em Ringer-lactato a 38oC. Os danos à integridade de membrana (IM), em osmolalidades acima deste valor, se estabeleceram no primeiro minuto de exposição e não se agravaram até 10 minutos depois. A motilidade (MOT) foi mais afetada que a IM. A rediluição abrupta em meio isosmótico causou dano extenso e proporcional ao grau de desidratação prévia. Nos experimentos seguintes, adição de 375 mM de sacarose ao diluidor TRIS-gema com 6,8% de glicerol (TGG), 5 minutos antes da congelação, resultou em MOT e IM similares ao controle TGG sem sacarose. Descongelação e rediluição a 4oC favoreceram a MOT e, a 38oC, favoreceram a IM. O diluente TRIS-gema com 375 mM de sacarose e concentração de glicerol reduzida para 1,7% apresentou melhor MOT e IM que o controle (65% e 187% vs 52% e 100%, respectivamente). A MOT após 2 h e o vigor após 6 h foram maiores quando a rediluição pós-descongelação foi em 5 passos se comparado a 3 passos (28% e 9% vs 19% e 2%, respectivamente). Na fase seguinte do trabalho, diluentes elaborados com 300 mM após 6 h a 38oC, melhor MOT e vigor que o controle (33% e 26% vs 15% e 10%, respectivamente). A descongelação a 20oC favoreceu a MOT e o vigor nos tempos zero, 2 h e 6 h pós-descongelação em todos os grupos contendo sacarose. O etilenoglicol não diferiu do glicerol na concentração de 3,4% quando adicionado a diluente contendo 300 mM de sacarose. Nestes diluentes, a rediluição em 5 passos a 20oC não diferiu em MOT e IM da feita em 1 passo a 38oC. No último experimento, sêmen congelado em diluente contendo 300 mM de trealose e zero% de glicerol mostrou melhor IM após descongelação em um passo a 38oC (320% vs 100% no controle) e maior MOT às 6 h após descongelação e rediluição em 5 passos a 20oC (56% vs 26% no controle). Conclui-se que o sêmen caprino tolera soluções de sacarose até o limite de 930 mOsm, mas a rediluição deve ser progressiva. A desidratação parcial, causada por soluções concentradas de sacarose ou trealose, permite a congelação de sêmen sem adição de crioprotetores permeantes. Os melhores resultados foram obtidos em diluente TRIS-gema sem glicerol e adicionado de 300 mM de trealose. / The objective of this study was to: 1) define the tolerance limits of goat sperm to hyperosmotic sucrose solutions; 2) establish an extender that minimizes cell volume variations during the processes of freezing and thawing. Boer goat semen was diluted with Ringer-lactate-Sucrose solutions at 38oC. The hyperosmotic tolerance limit was 930 mOsm evaluated with eosin-nigrosin stain. At osmolalities above this value, damage was evident after 1 min and was not affected by further exposure. Redilution in a single step resulted in massive membrane damage that was nearly proportional to the dehydration intensity previously undergone. Motility (MOT) was more distinctly impaired than membrane integrity (MI). In the next experiments, addition of 375 mM sucrose (Suc) 5 min previous to freezing to TRIS-egg yolk extender containing 6.8% glycerin (TYG) resulted in sperm motility (MOT) and MI similar to control extender TYG without sucrose. Thawing and redilution at 4oC affected favorably the MOT, and at 38oC, was favorable to MI. When freezing in TRIS-egg yolk-Suc extenders with low glycerin concentration (1.7%) MOT and MI were significantly higher than in the control TYG (65% and 187% vs 52% and 100%, respectively). MOT 2 h after thawing and intensity of motility (INTMOT) after 6 h after thawing were better preserved after a redilution of 5 increasing volume-steps than after redilution of 3 steps (28% and 9% vs 19% and 2%, respectively). In sequence, extenders containing 300 mM sucrose and thawed-rediluted 5 steps at 20oC improved MOT and INTMOT after 6 h (33% and 26% vs 15% and 10% in the control Group). The thawing-redilution at 20oC improved the results in all groups containing sucrose. At a concentration of 3.4% added to TRIS-yolk extender with 300 mM sucrose, the cryoprotectant ethylene glycol gave similar results as glycerin. MOT and INTMOT in the different time intervals were not influenced by redilution in 5 steps at 20oC or in one step at 38<SUPoC. In the last experiment made, semen frozen in a TRIS-yolk extender with 300 mM trehalose and devoid of glycerin showed the best MI after thawing-redilution in 1 step at 38oC (320% vs 100% in the control Group). The highest MOT after 6 h incubation was observed when this group was thawed-rediluted at 20oC in 5 steps (56% vs 26% in the control). From the results obtained it may be concluded that the upper tolerance limit of goat spermatozoa to hyperosmotic sucrose solutions is 930 mOsm. The redilution and return to isosmolality should be stepwise made. Goat semen can be frozen in extenders devoid of permeant cryoprotectants like glycerin when, previous to freezing, the cells are partially dehydrated by concentrated sucrose or trehalose solutions. The best survival rate was obtained when freezing goat spermatozoa in a glycerin-free TRIS-yolk-extender containing 300 mM of trehalose.

Foi conduzida uma série de experimentos onde se buscou definir: 1) o limite de tolerância do espermatozóide caprino a soluções hiperosmóticas de sacarose; 2) um diluente para criopreservação de sêmen que minimizasse as flutuações de volume celular. O limite de tolerância da membrana, avaliado pelo corante eosina-nigrosina, foi de 930 mOsm em soluções de sacarose em Ringer-lactato a 38oC. Os danos à integridade de membrana (IM), em osmolalidades acima deste valor, se estabeleceram no primeiro minuto de exposição e não se agravaram até 10 minutos depois. A motilidade (MOT) foi mais afetada que a IM. A rediluição abrupta em meio isosmótico causou dano extenso e proporcional ao grau de desidratação prévia. Nos experimentos seguintes, adição de 375 mM de sacarose ao diluidor TRIS-gema com 6,8% de glicerol (TGG), 5 minutos antes da congelação, resultou em MOT e IM similares ao controle TGG sem sacarose. Descongelação e rediluição a 4oC favoreceram a MOT e, a 38oC, favoreceram a IM. O diluente TRIS-gema com 375 mM de sacarose e concentração de glicerol reduzida para 1,7% apresentou melhor MOT e IM que o controle (65% e 187% vs 52% e 100%, respectivamente). A MOT após 2 h e o vigor após 6 h foram maiores quando a rediluição pós-descongelação foi em 5 passos se comparado a 3 passos (28% e 9% vs 19% e 2%, respectivamente). Na fase seguinte do trabalho, diluentes elaborados com 300 mM após 6 h a 38oC, melhor MOT e vigor que o controle (33% e 26% vs 15% e 10%, respectivamente). A descongelação a 20oC favoreceu a MOT e o vigor nos tempos zero, 2 h e 6 h pós-descongelação em todos os grupos contendo sacarose. O etilenoglicol não diferiu do glicerol na concentração de 3,4% quando adicionado a diluente contendo 300 mM de sacarose. Nestes diluentes, a rediluição em 5 passos a 20oC não diferiu em MOT e IM da feita em 1 passo a 38oC. No último experimento, sêmen congelado em diluente contendo 300 mM de trealose e zero% de glicerol mostrou melhor IM após descongelação em um passo a 38oC (320% vs 100% no controle) e maior MOT às 6 h após descongelação e rediluição em 5 passos a 20oC (56% vs 26% no controle). Conclui-se que o sêmen caprino tolera soluções de sacarose até o limite de 930 mOsm, mas a rediluição deve ser progressiva. A desidratação parcial, causada por soluções concentradas de sacarose ou trealose, permite a congelação de sêmen sem adição de crioprotetores permeantes. Os melhores resultados foram obtidos em diluente TRIS-gema sem glicerol e adicionado de 300 mM de trealose. / The objective of this study was to: 1) define the tolerance limits of goat sperm to hyperosmotic sucrose solutions; 2) establish an extender that minimizes cell volume variations during the processes of freezing and thawing. Boer goat semen was diluted with Ringer-lactate-Sucrose solutions at 38oC. The hyperosmotic tolerance limit was 930 mOsm evaluated with eosin-nigrosin stain. At osmolalities above this value, damage was evident after 1 min and was not affected by further exposure. Redilution in a single step resulted in massive membrane damage that was nearly proportional to the dehydration intensity previously undergone. Motility (MOT) was more distinctly impaired than membrane integrity (MI). In the next experiments, addition of 375 mM sucrose (Suc) 5 min previous to freezing to TRIS-egg yolk extender containing 6.8% glycerin (TYG) resulted in sperm motility (MOT) and MI similar to control extender TYG without sucrose. Thawing and redilution at 4oC affected favorably the MOT, and at 38oC, was favorable to MI. When freezing in TRIS-egg yolk-Suc extenders with low glycerin concentration (1.7%) MOT and MI were significantly higher than in the control TYG (65% and 187% vs 52% and 100%, respectively). MOT 2 h after thawing and intensity of motility (INTMOT) after 6 h after thawing were better preserved after a redilution of 5 increasing volume-steps than after redilution of 3 steps (28% and 9% vs 19% and 2%, respectively). In sequence, extenders containing 300 mM sucrose and thawed-rediluted 5 steps at 20oC improved MOT and INTMOT after 6 h (33% and 26% vs 15% and 10% in the control Group). The thawing-redilution at 20oC improved the results in all groups containing sucrose. At a concentration of 3.4% added to TRIS-yolk extender with 300 mM sucrose, the cryoprotectant ethylene glycol gave similar results as glycerin. MOT and INTMOT in the different time intervals were not influenced by redilution in 5 steps at 20oC or in one step at 38<SUPoC. In the last experiment made, semen frozen in a TRIS-yolk extender with 300 mM trehalose and devoid of glycerin showed the best MI after thawing-redilution in 1 step at 38oC (320% vs 100% in the control Group). The highest MOT after 6 h incubation was observed when this group was thawed-rediluted at 20oC in 5 steps (56% vs 26% in the control). From the results obtained it may be concluded that the upper tolerance limit of goat spermatozoa to hyperosmotic sucrose solutions is 930 mOsm. The redilution and return to isosmolality should be stepwise made. Goat semen can be frozen in extenders devoid of permeant cryoprotectants like glycerin when, previous to freezing, the cells are partially dehydrated by concentrated sucrose or trehalose solutions. The best survival rate was obtained when freezing goat spermatozoa in a glycerin-free TRIS-yolk-extender containing 300 mM of trehalose.

A espécie Callithrix jacchus pode ser utilizada como modelo experimental para outras espécies de primatas neotropicais, principalmente Callithriquídeos. Colheu-se sêmen desta espécie com os objetivos de otimizar a colheita de sêmen por vibro estimulação peniana, validar técnicas de avaliação espermática que possam ser utilizadas a campo, comparar as características seminais de indivíduos de duas colônias (Brasil e Alemanha), testar diferentes protocolos de congelação espermática e avaliar a atividade citoquímica mitocondrial (DAB) e a fragmentação de DNA de espermatozóides congelados. As técnicas de coloração para avaliação espermática utilizadas foram: eosina-nigrosina, coloração dupla trypan-blue giemsa, coloração simples para acrossoma, FITC-PSA, SpermOscan®, Spermac®, coloração com 3,3&#39;-diaminobenzidina (DAB) e ensaio Cometa alcalino. A congelação foi realizada com 100 µL de sêmen com meio TEST-Gema de ovo clarificado com glicerol 4% em palhetas 0,25 mL, e os protocolos de congelação testados foram: 1) fase de equilíbrio com curva de resfriamento (25°C-4°C) em 2 horas, 10 minutos no vapor de nitrogênio e finalmente imersão em nitrogênio líquido; 2) como Protocolo 1, mas sem fase de equilíbrio/resfriamento; e 3) diretamente no nitrogênio líquido. As palhetas foram descongeladas em água a 37°C por 5-10 segundos. A técnica de colheita resultou em 83,33% dos procedimentos com ejaculação. A coloração simples para acrossomo foi eficiente e pôde ser validada para utilização a campo. Não houve diferença significante (p<0,05) nas características seminais avaliadas entre as colônias do Brasil e da Alemanha. As análises pós-descongelação demonstraram queda nas variáveis motilidade e integridade da membrana plasmática com discreta superioridade no Protocolo 1, não houve diferença significante (p<0,05) entre os protocolos para a atividade citoquímica mitocondrial e o Protocolo 2 apresentou a menor taxa de fragmentação de DNA. / The Callithrix jacchus can be used as a model species for other Neotropical primates species, mainly Callithriquids, for reproductive studies. Semen samples were collected with the following objectives: to improve the penile vibrostimulation technique, validate sperm evaluation techniques for field work, analyse the semen characteristics from animals at 2 colonies (Brazil and Germany), use 3 different freezing protocols in common marmosets sperms, evaluate a cytochemical technique for mitochondrial activity demonstration and evaluate DNA damage in frozen-thawed sperms. The staining techniques used in this work were: Eosin-nigrosin, Trypan-blue Giemsa, simple staining for acrosome, FITC-PSA, SpermOscan®, Spermac®, demonstration of cytochrome c oxidase activity in situ by the oxidation of 3,3&#39;-diaminobenzidina (DAB) and the Comet assay. Freezing was done in 100 µL semen with TESt-Yolk clarified medium plus 4% glycerol using 0.25 mL straws. The freezing protocols tested were: 1) straws at equilibrium phase with a 25°C to 4°C curve in 2 hours, 10 minutes at nitrogen vapour and finally into liquid nitrogen; 2) same as Protocol 1 without the equilibrium phase; and 3) straws directly into liquid nitrogen. All attempts resulted in 83,33% ejaculates. The simple staining technique for acrosome was validated and resulted in an obvious differentiation of the intact acrosome. Semen characteristics evaluation showed no difference between the 2 colonies. Post-thaw evaluation showed all protocols had negative effects on motility and plasmatic membrane integrity with a slightly superiority on Protocol 1. There was no difference between protocols in the mitochondrial activity demonstration and Protocol 2 presented the lowest DNA damage.

A resistência de bovinos Bos taurus taurus a ambientes tropicais é menor quando comparada com a de Bos taurus indicus. Essa característica influencia os aspectos reprodutivos e vem sendo amplamente descrita na literatura. No que diz respeito aos touros, esta influência torna-se ainda mais significativa, visto que uma menor fertilidade destes impõe enorme impacto na produção animal. Vários são os estudos que comprovam o efeito negativo do estresse térmico sobre os parâmetros seminais de touros europeus provocando diminuição da fertilidade, porém a patogenia deste quadro não está confirmada. Uma hipótese para esta menor fertilidade seria um maior nível de estresse oxidativo nos touros europeus, no qual haveria um desequilíbrio entre a produção de espécies reativas ao oxigênio (EROs) e os níveis de proteção antioxidante. Para testar esta hipótese, foram utilizados 20 touros Simental (Bos taurus taurus) e 20 touros Nelore (Bos taurus indicus), criados a campo, na região de Dourados, Mato Grosso do Sul, submetidos a duas coletas anuais, durante o verão e inverno, no período de dois anos consecutivos. As amostras foram analisadas através da análise espermática padrão, dos níveis das enzimas antioxidantes, catalase e superóxido dismutase (SOD), e dos níveis de malondialdeído (MDA), produto da peroxidação lipídica, que foi utilizado como índice de estresse oxidativo. Os dados foram analisados pela análise de variância ONEWAY, levando em conta as classes raça (Nelore e Simental) e estação do ano (verão e inverno), através do programa SAS for Windows. As variáveis defeitos menores, defeitos totais e motilidade não apresentaram diferenças quanto a raça ou estação do ano. Observou-se efeito de estação do ano sobre as variáveis defeitos maiores (20,32±15,30% e 12,17±12,27%, verão e inverno respectivamente; p=0,02) e MDA (842,66±527,98 e 419,30±434,14 ng/ml, verão e inverno respectivamente; p=0,006), apenas no sêmen dos touros de raça Simental. As concentrações das enzimas antioxidantes SOD e catalase, não diferiram entre as raças e tampouco entre as estações do ano. Observou-se correlação entre MDA e formas anormais de cabeça (r=0,39, p=0,0035) e entre SOD e defeitos primários (r= - 0,31, p=0,0075). Os resultados obtidos sugerem que houve um maior nível de estresse oxidativo nos animais de origem européia criados a campo em clima tropical em relação aos animais de origem indiana, provavelmente relacionado a uma produção excessiva de EROs sem a devida compensação antioxidante. / Resistance to tropical environments is lower in Bos taurus taurus than in Bos taurus indicus cattle. This trait influences reproductive aspects, and is greatly discussed in publications worldwide. This negative influence is much more significant in bulls, since lower fertility in them highly impacts animal production. There are many studies demonstrating that exposure of European bulls to heat stress will negatively affect their seminal parameters, leading ultimately to lower fertility rates, but the pathogenic pathway has not been clarified. One hypothesis is that this lower fertility is due to higher levels of oxidative damage in these bulls, in which there would be an imbalance between reactive oxygen species (ROS) production and antioxidant capacity. In order to test this hypothesis, 20 Simmental bulls (Bos taurus taurus) and 20 Nelore bulls (Bos taurus indicus) kept under extensive breeding in the Dourados region, in Mato Grosso do Sul state were used. Semen collection occurred twice a year, during summer and winter, for a two year period. Samples were submitted to standard semen analysis and the levels of the antioxidant enzymes catalase and superoxide dismutase (SOD) dismutase were measured. To evaluate oxidative damage to the cells the levels of the lipid peroxidation product malondialdehyde (MDA) were measured. Data were analyzed for breed (Nelore or Simmental) and season (summer or winter) by the ONEWAY analysis of variance, using the SAS for Windows. Minor defects, total defects and motility did not differ in breed or in season. Season showed an effect on major defects (20.32±15.30% and 12.17±12.27%, summer and winter respectively; p=0.02) and MDA (842.66±527.98 and 419.30±434.14 ng/mL, summer and winter respectively; p=0.006), only in the Simmental animals. SOD and catalase levels did not differ between breeds or seasons. Correlations were observed between MDA and sperm head defects (r=0.39, p=0.0035) and between SOD and primary defects (r= -0.31, p=0.0075). Results suggest a higher level of oxidative stress in European bulls raised in field conditions, when compared to Indian bulls under the same conditions, and this is probably due to a higher ROS production, without a concomitant increase in antioxidant levels.

Foram analisadas, para fins de diagnóstico das micoplasmoses da reprodução, 105 amostras de muco prepucial e 80 amostras de sêmen in natura, provenientes de touros de quatro propriedades rurais e 70 amostras de muco prepucial e 63 amostras de sêmen in natura, provenientes de touros de uma central de inseminação artificial, localizadas no Estado de São Paulo. As amostras foram submetidas ao isolamento bacteriano e PCR, para demonstração de presença de Mycoplasma bovis, M. bovigenitalium e Ureaplasma diversum. Colheitas foram realizadas no período de 1999 à 2002, antes e após a implantação de dois métodos de antibioticoterapia, utilizando-se para tal, oxitetraciclina di-hidratada ou fumarato de hidrogênio de tiamulin. O Sistema MGSO/GPO-1 de detecção de Mycoplasmatales pela PCR foi testado frente ao isolamento bacteriano. A associação entre a idade e forma de manejo reprodutivo, além da qualidade seminal e a presença dos microrganismos foi analisada através da odds ratio. A eficiência dos métodos de tratamento sobre a qualidade seminal dos touros foi analisada estatisticamente pelos testes de Mann Whitney e Wilcoxon. As freqüências de detecção de Mycoplasma spp pelo isolamento e pela PCR nas amostras de muco prepucial, foram 45,1 e 63,7%, respectivamente. Nas amostras de sêmen, as freqüências foram 22,5% (isolamento) e 24,1 (PCR). O Sistema MGSO/GPO-1 mostrou-se pouco eficiente na detecção dos agentes. Análise estatística revelou que animais com menos de quatro anos têm de 1,39 (M. bovigenitalium) até 7,54 (U. diversum) vezes mais chance de serem portadores dos microrganismos. A odds ratio de 4,01 até 4,68 (muco prepucial) e de 1,71 até 18,29 (sêmen) mostrou a importância da higiene no manejo reprodutivo. Os animais da Central de Inseminação Artificial apresentaram resposta significativa sobre a motilidade espermática no tratamento com oxitetraciclina (p=0,033). As estimativas de risco, pós-tratamento, foram menores para os parâmetros motilidade e defeitos menores, associados à Mycoplasma spp e, motilidade e defeitos maiores, associados à U. diversum . / Prepucial mucuses and fresh semen were collected from bulls under two kinds of reproductive management: a) natural breeding with cows in four farms, b) an Artificial Insemination Center. All of them located in São Paulo State, Brazil. The samples were collected from 1999 to 2002. In the farms it were collected 105 samples of prepucial mucuses and 80 samples of fresh semen and in the Artificial Insemination Center, 70 samples of prepucial mucuses and 63 of fresh semen. The laboratory tests applied for demonstration of Mycoplasma bovis, M. bovigenitalium and Ureaplasma diversum were classical cultivation and polymerase chain reaction (PCR). The therapeutic assay were performed with oxytetracicline, 20 mg./kg. of body weight, IM, or tiamulin hydrogen fumarate, 15 mg./kg. of body weight, IM. Mycoplasma spp was demonstrated in 45,1% and 63,7% of prepucial mucuses samples, respectively by cultivation and PCR and in 22,5% and 24,1% of fresh semen samples, respectively by cultivation and PCR. Ureaplasma diversum was demonstrated in 66,5% and 72,9% of prepucial mucuses samples, respectively by cultivation and PCR and in 51,7% and 56,6% of fresh semen samples, respectively by cultivation and PCR. The MGSO/GPO-1 PCR System, was able for demonstration of Mycoplasma spp DNA in bovine semen and U. diversum in prepucial mucuses, with results in agreement with cultivation. Animals younger than four years of age presented a higher infection rate than older: odds ratio 1.39 (M. bovigenitalium) and up to 7.54 (U. diversum). Odds ratio from 4.01 to 4.68 (prepucial mucuses) and from 1.71 to 18.29 (semen) showed the importance of the hygienic status of the reproduction management. The animals from Insemination Center, showed better motility after the treatment with oxytetracicline (p=0,033). After therapeutic assay, the odds ratio was small for the motility and morphologic aspects of the semen associated to Mycoplasma spp and U. diversum contamination.

A ema (Rhea americana), é uma ave nativa da América do Sul, e pertence ao grupo das Ratitas. Considerando a importância comercial desse animal foram implantadas algumas biotecnologias reprodutivas, como coleta e avaliação de sêmen que ajudariam na preservação da espécie, assim como na disseminação de material genético. Nesse estudo utilizou-se 107 animais, dentro e fora da estação reprodutiva, com idade entre 3 e 4 anos, que encontravam-se no Estado de São Paulo, durante os anos de 2001, 2002 e 2003. Observou-se os animais para identificação de dominância. Os machos foram contidos em caixa de madeira adaptada e capuz preto. Após a contenção realizou-se a coleta de sêmen através de massagem digital. Os falos foram analisados quanto ao tamanho e formação de espiral. Alguns parâmetros seminais foram avaliados: volume, motilidade, concentração e número de espermatozóides por ejaculado. Foi coletado sangue da veia metatarsal, de animais dentro e fora da estação reprodutiva para dosagem de nível plasmático de testosterona. Dos 69 animais em estação reprodutiva, 44 apresentaram falos grandes e desses, 26 formaram espiral. A coleta de sêmen através de massagem digital mostrou-se eficiente para esses animais. O sêmen foi analisado quanto ao volume (0,68±0,14), motilidade (61,11±11,54%), concentração (3,29±1,33x109sptz/ml) e número por ejaculado (2,40±1,38x109sptz/ml) e foram descritas algumas patologias espermáticas. Encontrou-se diferença estatística significante (p=0,0161) de níveis plasmáticos de testosterona em animais dentro e fora da estação reprodutiva (53,28±18,41ng/ml e 5,57±3,81ng/ml, respectivamente). Foram relatadas variações de tamanho de falos em animais dentro e fora da estação e animais em estação reprodutiva. Observou-se que animais que apresentavam falos maiores e níveis plasmáticos de testosterona foram os considerados dominantes através de observações comportamentais. Os resultados do presente experimento confirmam a possibilidade de coleta de sêmen de emas e o seu uso em futuras biotecnologias como a inseminação artificial. / The rhea (Rhea americana), a native bird from South America, belongs to the Ratite group. Considering the commercial significance of this animal were standardize some techniques such as semen collection. These techniques aim to optimize the reproductive traits of this animal and to allow the dissemination and preservation of the genetic material of this endangered specie. In this study, 107 male rheas were used. The animals were around 3 and 4 years old and were raised in São Paulo’s State commercial breeding. Semen collections were performed during breeding and non breeding seasons of 2001, 2002 and 2003. Animals were observed in order to detect hierarchic behavior. Contention was performed using a box and a black hood. Semen collection was performed through a digital pressure in the base of the phallus, which were observed in order to detect size and spiral shape. Immediately after collection semen samples were evaluated for volume, motility, sperm concentration and morphology. In a limited number of animals, blood samples were collected by the metatarsal vein in order to measure testosterone levels. Among 69 animals in breeding season, 44 showed larger phallus and among those, 26 showed spiral shape. The method of semen collection showed good results. Semen was then evaluated for volume (0.68±0.14 ml), motility ( 61.11±11.54%), sperm concentration (3,29±1,33x109sptz/ml) and number of spermatozoa per ejaculate (2.40±1.38x109sptz/ml). Morphological abnormalities were analyzed and accounted. Statistical differences (p=0.0161) were found for testosterone levels between animals during breeding and non-breeding season (53.28±18.41ng/ml e 5.57±3.81ng/ml, respectively). It was observed that animals showed variations in phallus size during breeding and non-breeding seasons. A relationship was found between animals with larger phallus and higher testosterone levels and dominant behavior. Results of the present experiment confirmed the possibility of collecting semen from rheas in order to use it in future biotechnologies such as artificial insemination.

Durante o processo de criopreservação o espermatozóide passa por mudanças estruturais nas membranas que resulta em diminuição da fertilidade. Este estudo foi realizado para comparar os efeitos de duas técnicas de congelação (técnica convencional e técnica automatizada), curvas de congelação e o uso de três crioprotetores (glicerol, etilenoglicol e dimetilformamida) sobre a motilidade, vigor e integridade das membranas espermáticas (plasmática, acrossomal e mitocondrial) do sêmen bovino. Foram utilizados cinco touros da raça Simental, coletados semanalmente por seis semanas. O semên foi avaliado e diluído em tris-gema (fração única), preparado previamente com os seguintes crioprotetores:- dimetilformamida (3%), etilenoglicol (7%) ou glicerol (7%). A metade das doses foi congelada pela técnica convencional (TC), da seguinte maneira:- seis quilogramas de gelo moído foi colocado em uma de uma caixa de isopor de 15 litros, quando então as palhetas a serem congeladas foram colocadas sobre um suporte, na posição horizontal, por 90 minutos (curva de resfriamento, -0,55°C/min). Imediatamente após, o suporte com as palhetas foi transferido para outra caixa de isopor onde as palhetas permaneceram em vapor de nitrogênio (3cm), por 15 minutos (curva de congelação, -19,1°C/min). A outra metade das palhetas foi criopreservada pela técnica automatizada (TA), utilizando-se um aparelho programável portátil de controle eletrônico (TK2000), com taxa de resfriamento de -0,23°C/minuto e taxa de congelação de -15,5°C/minuto. Após a congelação as palhetas foram mantidas em botijões criogênicos e descongeladas para avaliação da motilidade (%) e vigor (1-5) por microscopia óptica. A integridade das membranas plasmática, acrossomal e mitocondrial foi avaliada utilizando-se o iodeto de propídio (PI); aglutinina de Pisum sativum conjugada a fluoresceína (FITC-PSA) e MitoTracker Green FM (MITO), respectivamente, por microscopia de epifluorescência. As análises estatísticas foram realizadas com o auxílio do Programa StatView® (SAS Institute, Cary, NC, USA). Não houve diferenças significativas entre as técnicas e nem interação entre crioprotetor e técnica de congelação (P>0,05) para os parâmetros avaliados. Houve diferença entre os crioprotetores (P<0,05), sendo que o glicerol preservou melhor a motilidade, o vigor e a integridade das membranas plasmática, acrossomal e mitocondrial dos espermatozóides quando comparado ao etilenoglicol e a dimetilformamida. O etilenoglicol foi superior à dimetilformamida para as avaliações da motilidade e da integridade das membranas plasmática e mitocondrial (P<0,05). Uma vez que, 85% dos espermatozóides apresentaram algum grau de lesão, isto nos conduz a inferir que pesquisas são necessárias para que se obtenha melhoria nos resultados após a criopreservação do sêmen bovino / During cryopreservation, spermatozoa undergo many changes leading to membrane damage which result in decreased fertility. This study was designed to compare the effects of two freezing techniques (conventional and automated), their freezing curves and the use of three cryoprotectants (glycerol, ethylene glycol and dimethylformamide) on the motility, vigor and integrity of spermatic membranes (plasmatic, acrosomal, and mitochondrial) of bovine semen. Five Simmental bulls ranging from 24 to 36 months age were submitted one a week to semen collection for six weeks. Semen samples were evaluated and diluted in TRIS-yolk medium (one step). Each semen collection dilutors were prepared previously with each of following cryoprotectants:- glycerol (7%), ethylene glycol (7%) or dimethylformamide (3%). Half of the amount of straws (0.5 mL) was frozen by a conventional manual technique (TC), as in following protocol:- six kilograms of ground ice were placed in the bottom of a thermal box (15 L), straws were cooled on a grid placed horizontally for 90 minutes (cooling rate, -0.55°C/min), immediately transferred to another thermal box and frozen in static liquid nitrogen vapor (15 min) on the same grid placed 3 cm above the liquid nitrogen (freezing rate, -19.1°C/min). The other half of straws was frozen by automated technique (TA). TA was performed using an electronic controlled programmed machine (TK2000) which cooling rate was -0.23°C/min and freezing rate was -15.5°C/min. Straws were plunged into liquid nitrogen and stored at -196°C. The motility (%) and vigor (1-5) were assessed using optic microscopy. The integrity of plasmatic, acrosomal and mitochondrial membranes were evaluated using propidium iodide (PI), fluorescein conjugated Pisum sativum agglutinin (FITC-PSA) and MitoTracker Green FM (MITO), respectively, by fluorescence microscopy. Effects of treatment were analyzed by StatView® Program, (SAS Institute, Cary, NC, USA). There were no significant differences (P>0.05) between the two freezing techniques and no interaction among cryoprotectant and freezing techniques for all assessed parameters. Glycerol showed better results (P<0.05) than other two cryoprotectants for motility, vigor, and integrity of plasmatic, acrosomal and mitocondrial membranes. Ethylene glycol was superior (P<0.05) than dimethylformamide in preserve motility, and integrity of plasmatic and mitochondrial membranes. Because 85% of spermatozoa showed some kind of post thawing injury, further studies are required to improve cryopreservation techniques used routinely for bovine semen

O presente trabalho visou avaliar se, em cães, o estresse provoca efeitos deletérios sobre os parâmetros seminais e a composição do plasma seminal. Além disso, avaliou-se os efeitos da suplementação oral com vitamina E em animais estressados. Utilizaram-se 18 cães machos da raça rotweiller, com idade média de 4 anos. O tratamento foi inteiramente casualizado com esquema fatorial 2x2 (com e sem estresse X com e sem vitamina E). Os animais dos grupos suplementados com vitamina E receberam 500 mg de -tocoferol/animal/dia. O estresse foi induzido, sete dias após o início da suplementação com vitamina E através da aplicação intramuscular de 0,01mg/kg de dexametasona, durante 7 dias consecutivos. O estresse foi caracterizado através do cortisol sérico, consumo alimentar, escore corporal e peso vivo. Foram feitas duas colheitas semanais de sêmen através de manipulação digital e uma coleta semanal se sangue. Os parâmetros utilizados para avaliar os efeitos do tratamento foram: volume, densidade e pH do ejaculado, motilidade, vigor, concentração e morfologia espermáticos, integridade da membrana espermática (teste de expansão hipo-osmótico, coloração fluorescente IP/DCF, coloração tripla, coloração acrossomal simples e viabilidade espermática), proteínas totais, grau de peroxidação lipídica (concentração de TBARS), concentração de catalase, superóxido dismutase, glutationa peroxidase no plasma seminal e nível de testosterona plasmática. Observou-se um efeito do estresse sobre o volume do ejaculado, pH do ejaculado, TBARS e porcentagem de células mortas com acrossoma reagido (classe 4 da coloração simples). A vitamina E atuou sobre a porcentagem de defeitos maiores, TBARS, a porcentagem de células com membrana acrossomal íntegra e sobre a viabilidade espermática. O efeito conjunto da vitamina E e do estresse foi observado sobre a motilidade, vigor e concentração espermáticos, a porcentagem de defeitos maiores, porcentagem de células íntegras pelo teste hipo-osmótico e através de sondas fluorescentes IP/DFC. Com base nos resultados obtidos neste experimento concluiu-se que o estresse influencia de maneira negativa a célula espermática e a composição do plasma e a suplementação oral com vitamina E modifica estes efeitos. / The present study aimed to evaluate if the stress in dogs may have deleterious effects on the sperm quality and on the composition of the seminal plasma. IN addition, the effect of supplementation with vitamin E on stressed dogs was also evaluated. Eighteen male adult rotweiller dogs were randomly allocated in a 2X2 factorial treatment design (stress and no stress X vitamin E supplementation and no supplementation). Animals of the supplemented group received 500 mg of -tocopherol/animal/day. The stress was induced 7 days after the beginning of the vitamin supplementation using dexamethasone (0.01 mg/kg intramuscular for 7 consecutive days). Stress was characterized through the measurement of plasmatic cortisol, food intake, body score and weight. Semen collections were performed twice a week through digital manipulation and blood collections were performed weekly. Semen parameters used to evaluate the effect of the treatments were: ejaculate volume, density and pH, sperm motility, vigor, concentration and morphology, sperm membrane integrity (hypo-osmotic swelling test - HOST, fluorescent probe IP/DCF, triple stain, simple acrosome stain and sperm viability), total protein concentration, lipid peroxidation rate (TBARS), enzymatic activity of the antioxidants catalase, superoxide dismutase, glutatione peroxidase in the seminal plasma and plasmatic testosterone concentration. The stress influenced the ejaculate volume and pH, TBARS and percentage of dead cells with reacted acrosome (class 4 of the simple stain). Vitamin E had na effect on the percentage of sperm major defects, TBARS, percentage of cells with intact acrosome and sperm viability. The effect of vitamin E and stress was observed on sperm motility, vigor and concentration, percentage of major sperm defects, percentage of intact membrane cells evaluated through the HOST and through the fluorescent probe IP/DFC. Results obtained indicated that the stress has a deleterious effect on the spermatic cell and that the composition of the seminal plasma and the oral vitamin E supplementation may modify this effects.