Introdução: Testes de estresse não-invasivos têm sido utilizados para otimizar o atendimento dos pacientes com dor torácica na emergência. Porém ainda não está completamente definido se o uso dessa ferramenta neste cenário modifica a evolução dos pacientes em longo prazo. Objetivo: Identificar o valor prognóstico em longo prazo do teste de estresse realizado nos pacientes com dor torácica aguda na emergência. Métodos: Pacientes com mais de 30 anos que procuraram a Emergência do Hospital de Clínicas de Porto Alegre por dor torácica e realizaram ergometria ou cintilografia miocárdica dentro de 30 dias da admissão. Foram excluídos os pacientes com diagnóstico de síndrome coronária aguda de alto risco ou infarto agudo de miocárdio. Foi realizado o seguimento por 24 meses após a primeira visita à emergência para identificar a ocorrência de eventos cardíacos: óbito cardíaco, reinternação de urgência por dor torácica aguda e revascularização miocárdica.Resultados: Foram atendidos 1003 pacientes com dor torácica e 116 realizaram teste de estresse. O teste foi realizado em média em 4,6 dias e a maioria (53%) dos pacientes realizou o teste até 72 horas da chegada. O teste foi positivo em 25% pacientes, negativo em 54% e inconclusivo em 21% casos. As características clínicas relacionadas com teste positivo foram: idade maior que 65 anos, uso de beta-bloqueador, escore de risco clínico > 3 e sexo masculino. Pacientes com 3 dessas 4 características tiveram probabilidade 4,7 vezes (IC95% 2,49-9,16) para um teste positivo. Após 17,5 meses de seguimento, pacientes com teste positivo tiveram um RR 3,0 (IC95%: 1,73-5,2) para eventos cardíacos (VPP 55%), e um teste negativo conferiu um valor preditivo negativo de 82%. Pacientes que realizaram o teste em até 72 horas e aqueles que tiveram diagnóstico na alta da emergência não compatível com SCA tiveram uma evolução mais benigna e, para estes pacientes, um teste negativo conferiu um valor preditivo negativo superior a 90%. Conclusões: Testes de estresse realizados na avaliação de dor torácica aguda têm uma relação forte e positiva com prognóstico em longo prazo. Não foi possível determinar características clínicas relacionadas com teste negativo. Os pacientes submetidos ao teste eram de um risco mais elevado e, conseqüentemente, o valor preditivo negativo era inferior ao esperado para este contexto clínico.

Introdução: Testes de estresse não-invasivos têm sido utilizados para otimizar o atendimento dos pacientes com dor torácica na emergência. Porém ainda não está completamente definido se o uso dessa ferramenta neste cenário modifica a evolução dos pacientes em longo prazo. Objetivo: Identificar o valor prognóstico em longo prazo do teste de estresse realizado nos pacientes com dor torácica aguda na emergência. Métodos: Pacientes com mais de 30 anos que procuraram a Emergência do Hospital de Clínicas de Porto Alegre por dor torácica e realizaram ergometria ou cintilografia miocárdica dentro de 30 dias da admissão. Foram excluídos os pacientes com diagnóstico de síndrome coronária aguda de alto risco ou infarto agudo de miocárdio. Foi realizado o seguimento por 24 meses após a primeira visita à emergência para identificar a ocorrência de eventos cardíacos: óbito cardíaco, reinternação de urgência por dor torácica aguda e revascularização miocárdica.Resultados: Foram atendidos 1003 pacientes com dor torácica e 116 realizaram teste de estresse. O teste foi realizado em média em 4,6 dias e a maioria (53%) dos pacientes realizou o teste até 72 horas da chegada. O teste foi positivo em 25% pacientes, negativo em 54% e inconclusivo em 21% casos. As características clínicas relacionadas com teste positivo foram: idade maior que 65 anos, uso de beta-bloqueador, escore de risco clínico > 3 e sexo masculino. Pacientes com 3 dessas 4 características tiveram probabilidade 4,7 vezes (IC95% 2,49-9,16) para um teste positivo. Após 17,5 meses de seguimento, pacientes com teste positivo tiveram um RR 3,0 (IC95%: 1,73-5,2) para eventos cardíacos (VPP 55%), e um teste negativo conferiu um valor preditivo negativo de 82%. Pacientes que realizaram o teste em até 72 horas e aqueles que tiveram diagnóstico na alta da emergência não compatível com SCA tiveram uma evolução mais benigna e, para estes pacientes, um teste negativo conferiu um valor preditivo negativo superior a 90%. Conclusões: Testes de estresse realizados na avaliação de dor torácica aguda têm uma relação forte e positiva com prognóstico em longo prazo. Não foi possível determinar características clínicas relacionadas com teste negativo. Os pacientes submetidos ao teste eram de um risco mais elevado e, conseqüentemente, o valor preditivo negativo era inferior ao esperado para este contexto clínico.

Introdução: Testes de estresse não-invasivos têm sido utilizados para otimizar o atendimento dos pacientes com dor torácica na emergência. Porém ainda não está completamente definido se o uso dessa ferramenta neste cenário modifica a evolução dos pacientes em longo prazo. Objetivo: Identificar o valor prognóstico em longo prazo do teste de estresse realizado nos pacientes com dor torácica aguda na emergência. Métodos: Pacientes com mais de 30 anos que procuraram a Emergência do Hospital de Clínicas de Porto Alegre por dor torácica e realizaram ergometria ou cintilografia miocárdica dentro de 30 dias da admissão. Foram excluídos os pacientes com diagnóstico de síndrome coronária aguda de alto risco ou infarto agudo de miocárdio. Foi realizado o seguimento por 24 meses após a primeira visita à emergência para identificar a ocorrência de eventos cardíacos: óbito cardíaco, reinternação de urgência por dor torácica aguda e revascularização miocárdica.Resultados: Foram atendidos 1003 pacientes com dor torácica e 116 realizaram teste de estresse. O teste foi realizado em média em 4,6 dias e a maioria (53%) dos pacientes realizou o teste até 72 horas da chegada. O teste foi positivo em 25% pacientes, negativo em 54% e inconclusivo em 21% casos. As características clínicas relacionadas com teste positivo foram: idade maior que 65 anos, uso de beta-bloqueador, escore de risco clínico > 3 e sexo masculino. Pacientes com 3 dessas 4 características tiveram probabilidade 4,7 vezes (IC95% 2,49-9,16) para um teste positivo. Após 17,5 meses de seguimento, pacientes com teste positivo tiveram um RR 3,0 (IC95%: 1,73-5,2) para eventos cardíacos (VPP 55%), e um teste negativo conferiu um valor preditivo negativo de 82%. Pacientes que realizaram o teste em até 72 horas e aqueles que tiveram diagnóstico na alta da emergência não compatível com SCA tiveram uma evolução mais benigna e, para estes pacientes, um teste negativo conferiu um valor preditivo negativo superior a 90%. Conclusões: Testes de estresse realizados na avaliação de dor torácica aguda têm uma relação forte e positiva com prognóstico em longo prazo. Não foi possível determinar características clínicas relacionadas com teste negativo. Os pacientes submetidos ao teste eram de um risco mais elevado e, conseqüentemente, o valor preditivo negativo era inferior ao esperado para este contexto clínico.

Seca e ferrugem asiática da soja (FAS) são dois dentre os principais estresses abióticos e bióticos que afetam negativamente a produtividade da soja (Glycine max L. Merrill) no mundo inteiro. A base genética da tolerância à seca e da resistência à FAS não são bem conhecidas e esclarecer como ocorre a resposta a estes estresses em soja é ainda um desafio. Atualmente, sabe-se que as plantas adaptam-se a estes estresses por meio da regulação da expressão gênica em nível transcricional e pós-transcricional. Na via da regulação pós-transcricional, microRNAs (miRNAs) têm sido apontados como importantes reguladores em várias plantas sob estresse biótico e abiótico. Entretanto, em soja, não havia sido relatado qualquer miRNA responsivo a estas condições. Neste contexto, nosso objetivo foi identificar novos miRNAs em soja e, também, caracterizar o padrão de expressão de alguns destes miRNAs durante ambos os estresses, além de buscar detectar genes alvos para estes miRNAs. Deste modo, esta tese foi dividida em capítulos, os quais apresentam os diferentes trabalhos desenvolvidos durante o doutorado. No capítulo III estão relatados os resultados da primeira investigação sobre a adequação de miRNAs como genes normalizadores em plantas. A estabilidade da expressão dos miRNAs foi investigada em diferentes tecidos e genótipos de soja, bem como entre estresses biótico e abiótico. Ao final deste trabalho, foram mostradas evidências de que a estabilidade da expressão de miRNAs pode ser maior que a de genes codificadores de proteínas em análises de RT-qPCR. No capítulo IV está descrita a descoberta de novos miRNAs a partir de bibliotecas de deficiência hídrica e FAS em soja, pelo emprego de sequenciamento de alto desempenho (Solexa). Neste estudo, foram detectados 256 miRNAs. Análises de RT-qPCR foram realizadas para alguns dos novos miRNAs, observando-se alguns miRNAs diferencialmente expressos, indicando evidência molecular para um possível envolvimento de miRNAs em processos responsivos à deficiência hídrica e FAS. Para um dos miRNAs detectado, um novo alvo foi validado, correspondendo a um gene codificador de ascorbato oxidase e possivelmente relacionado com a infecção pelo fungo da ferrugem asiática em genótipo suscetível, dados estes apresentados no capítulo V. Esta tese contribui para o aumento de informações sobre miRNAs de plantas, bem como para o entendimento da regulação gênica em soja sob estresses de deficiência hídrica e FAS. / Drought and Asian Soybean Rust (ASR) are the major abiotic and biotic stresses that negatively affect soybean (Glycine max L. Merrill) productivity around the world. The genetic basis of drought tolerance and ASR resistance are not well understood, and clarification on how the response to these stresses occur in soybean is still a challenge. Currently, it is known that adaptation is achieved through the regulation of gene expression at the transcriptional and post-transcriptional levels. In the way of post-transcriptional regulation, microRNAs (miRNAs) have been found to act as key regulator factors in many other plants under biotic and abiotic stresses. However, in soybean there was no report of miRNAs responsive to these conditions. In this context, our goal was to identify new miRNAs in soybean, characterize some of the miRNA expression patterns during both stresses, and try to detect target genes for the miRNAs. In this way, this thesis was divided in chapters which present the different works that were developed during the PhD period. In chapter three, the suitability of miRNAs as housekeeping genes in plants was investigated. MiRNA expression stability was analysed in different soybean tissues and genotypes as well as after abiotic or biotic stress treatments. It was shown that miRNA expression stability can be higher than the expression stability of protein-coding genes by RT-qPCR analysis. In chapter four, new miRNAs were discovered from Solexa deep sequencing of soybeans submitted to water deficit and rust infection. From these analyses 256 miRNAs were detected. RT-qPCRs were performed for some of the new miRNAs and the identification of differentially expressed miRNAs was observed, provinding molecular evidence for the possible involvement of miRNAs in the process of water deficit- and rust-stress responses. For one of the new miRNAs detected by Solexa sequencing, a new target was validated, which is a gene encoding ascorbate oxidase and that seems to be related with soybean rust infection in the genotype susceptible to the fungus (results were presented in chapter five). The present thesis contributes to improve the information about miRNAs in plantas, as well as to the understanding of soybean gene regulation under water deficit and ASR stresses.

A transformação genética é uma ferramenta importante para o estudo funcional de genes e obtenção de plantas com novas características agronômicas. A introdução de genes pela engenharia genética requer, para sua expressão otimizada, além de genes de interesse, a utilização de seqüências reguladoras da transcrição (promotores) eficazes. A obtenção de sequências promotoras raiz-específicas seria de grande valia para trabalhos de transformação genética de soja com vista à obtenção de resistência a nematóides e fungos, uma vez que permitiria o direcionamento da expressão de proteínas capazes de combater estes patógenos e outras pragas apenas nos órgãos-alvo do ataque, ou seja, raízes. O presente trabalho relata a caracterização inicial de quatro promotores de soja potencialmente raiz-específicos - GmAQP, GmAS2, GmEXT e GmRB7. A obtenção de raízes transformadas por Agrobacterium rhizogenes é uma ferramenta bastante útil para testar promotores e novos genes de interesse. Para a implementação do método de transformação mediada por A. rhizogenes em nosso laboratório, foram necessárias algumas etapas fundamentais, como a escolha de cultivares mais propícias para a transformação. Neste trabalho, foi identificada a cultivar MG/BR 46 Conquista como a que apresenta maior eficiência de transformação e menor tempo para a produção de raízes transgênicas, dois parâmetros fundamentais para tornar a técnica mais eficiente. A metodologia simples, pouco laboriosa e de rápida obtenção de resultados é essencial para atender as demandas da genômica funcional. O método já está bem estabelecido no laboratório e, além da aplicação na análise de promotores, vem sendo utilizado para testar novos genes candidatos para a transformação da soja e para a localização subcelular de proteínas codificadas pelos genes em estudo. Diversos fatores limitam a maior produtividade da soja, sendo as doenças os mais importantes e difíceis de controlar. Entre os fatores abióticos, a falta de água é responsável pela diminuição da produtividade agrícola, além de restringir as latitudes e os solos onde espécies comercialmente importantes podem ser cultivadas. Com o objetivo de aumentar a resistência a estresses abióticos e bióticos foi introduzido em soja o gene SnOLP, que codifica uma osmotina de Solanum nigrum. Foram obtidas três linhagens transgênicas, todas com uma única cópia do transgene. As análises de gerações segregantes confirmaram a integração estável do transgene. A linhagem B1, proveniente da transformação da cultivar Bragg, apresenta melhores resultados, tanto na resposta a estresses bióticos (fungos) quanto abióticos (seca). Os resultados obtidos no presente estudo mostram que existe potencial para a aplicação do gene SnOLP em estratégias de melhoramento da soja. / Genetic transformation is an important tool for functional studies of genes and generation of plants with new traits. The introduction of genes by genetic engineering requires for its optimal expression, effective transcription regulatory sequences (promoters). Root-specific promoter sequences would be valuable for studies on soybean genetic transformation to obtain nematode and fungal resistance, since they allow the expression of the interest protein in organs usually attacked by diseases - the roots. This thesis reports the initial characterization of four putative root-specific soybean promoters - GmAQP, GmAS2, GmEXT and GmRB7. Transgenic roots transformed by Agrobacterium rhizogenes are useful tool for screening of new promoters and genes of interest. To implement the transformation method mediated by A. rhizogenes in our lab, it was necessary some previous key steps, such as the choice of cultivars more susceptible to the bacteriam infection. MG/BR 46 Conquista cultivar was found to be the most susceptible and can be recommended for A. rhizogenes-mediated transformation experiments. The methodology is simple and fast, essential characteristics to meet the demands of functional genomics. The method is well established in the laboratory and, in addition to analysis of promoters, it has been used to test new genes for soybean transformation and subcellular localization of proteins encoded by the genes under study. Among the many factors that limit soybean yield, diseases are among the most important and difficult to control. Furthermore, the water deficit constrains agricultural productivity, restricting the latitudes and soils where commercially important species can be cultivated. Aiming to obtain increased resistance to abiotic and biotic stresses the osmotin encoding gene (SnOLP) from Solanum nigrum was introduced into soybean cultivars. Three transgenic lines with one transgene copy were obtained. The segregation analysis confirmed the stable integration of SnOLP. In vitro bioassays indicate that B1 transgenic line, derived from Bragg cultivar, was more resistant against economically important pathogenic fungi as well as more tolerant to drought. The results of this study show potential application of SnOLP in strategies for soybean breeding.

Vários estudos mostram que exposição ao estresse crônico induz alterações na nocicepção. Essas alterações são dependentes de vários fatores. Por exemplo, há diversos trabalhos que sugerem que hormônios gonadais, incluindo o estradiol, possam modular respostas nociceptivas em diferentes fases do ciclo estral em ratas. Os efeitos sobre as respostas nociceptivas induzidas por estresse e por estradiol possivelmente envolvem mudanças neuroquímicas em regiões do sistema nervoso central, como a medula espinhal. O glutamato é de fundamental importância na sinalização nociceptiva. Além disso, a transmissão glutamatérgica poder ser regulada por hormônios do estresse e estradiol, e seu desequilíbrio pode induzir um estado de estresse oxidativo. Partindo do exposto acima, nosso objetivo foi (1) avaliar o envolvimento do estresse repetido e da reposição com estradiol em ratas ovariectomizadas sobre a nocicepção, utilizando a medida da latência de retirada de cauda antes e após a exposição a sabores palatáveis (doce) e não palatáveis (ácido); (2) avaliar o envolvimento do estresse crônico e da reposição com estradiol em ratas ovariectomizadas sobre a liberação e captação de glutamato em sinaptossomas de medula espinhal; e (3) avaliar o envolvimento do estresse crônico e da reposição com estradiol em ratas ovariectomizadas sobre parâmetros de estresse oxidativo. Primeiro, ratas Wistar foram ovariectomizadas (OVX) e divididas em 2 grupos: com reposição de estradiol e veículo (óleo de girassol), e então subdivididas em 2 grupos: submetidas ao estresse crônico (contenção durante 40 dias, 5 dias/semana, 1h/dia), e controles (sem estresse), resultando nos seguintes grupos experimentais: CO (controle-óleo); CH (controle-hormônio); EO (estresse-óleo) e EH (estresse-hormônio). Após o período de estresse crônico foi avaliada a medida da latência de retirada de cauda (basal) e após a exposição aos sabores doce (Froot Loops) e ácido (ácido acético 5%). Verificamos que houve interação entre o tratamento com estradiol e a exposição ao sabor doce, aumentando o limiar nociceptivo, porém não houve diferença na medida da latência basal. Houve efeito do ácido aumentando o limiar nociceptivo em todos os grupos e houve interação significativa entre o estresse crônico e a exposição ao ácido, potencializando o aumento do limiar nociceptivo nos grupos estressados. Vinte e quatro h após a última sessão de estresse as ratas foram decapitadas e a medula espinhal dissecada, sendo verificado a captação de liberação de glutamato em sinaptossomas. Houve um aumento da captação de glutamato nas ratas com reposição de estradiol e uma diminuição nos animais submetidos ao estresse crônico. Observou-se também um aumento da expressão dos transportadores de glutamato analisados por western blot (GLAST, GLT1 e EAAC1) no grupo EO, sem efeito do estresse sobre a expressão desses transportadores. Não houve diferença significativa na liberação de glutamato. No que concerne a avaliação do estresse oxidativo, houve uma diminuição do potencial antioxidante total (TRAP) e um aumento da atividade da superóxido dismutase (SOD) naqueles animais submetidos ao estresse crônico (EO e EH). Além disso, os grupos com reposição de estradiol (CH e EH) apresentaram uma diminuição da atividade da enzima glutationa peroxidase (GPx). Não houve diferença na lipoperoxidação analisada pelo teste de TBARS. Os resultados acima sugerem que o estradiol module a resposta nociceptiva ao sabor doce. O ácido acético foi capaz de induzir antinocicepção, e esse efeito foi potencializado pelo estresse. Os resultados sobre a captação de glutamato sugerem um possível efeito neuroprotetor da reposição com estradiol, aumentando a captação de glutamato pela diminuição de seus transportadores. Em contraste, o estresse crônico diminui a captação de glutamato. Além disso, o estresse crônico diminuiu defesas antioxidantes e aumenta a atividade da enzima SOD, talvez por um aumento da formação de íons superóxidos. Com isso, tanto a exposição ao estresse crônico como o tratamento de reposição de estradiol parecem induzir mecanismos plásticos na medula espinhal.

A cafeína é uma substância amplamente consumida na forma de café, chás e refrigerantes. Estudos demonstram sua influência no comportamento alimentar aparentemente promovendo uma pequena redução na ingestão de calorias e no comportamento do tipo ansioso, onde altas doses podem induzir um estado de ansiedade. Além disso, ela parece ser neuroprotetora, e é possível que parte desse efeito seja devido a sua atividade antioxidante a qual está bem descrita in vitro. O consumo de cafeína muitas vezes está associado a situações de estresse. A exposição ao estresse crônico leva a alterações bioquímicas e comportamentais, tendo sido sugerido que aumenta a produção de radicais livres. O objetivo deste trabalho é verificar o efeito do consumo de cafeína e do estresse crônico sobre os parâmetros comportamentais, comportamento do tipo ansioso e alimentar e sobre parâmetros bioquímicos relacionados ao estresse oxidativo em hipocampo, estriado e córtex cerebral de ratos. Além disso, diferenças sexo-específicas foram verificadas com relação ao comportamento do tipo ansioso e ao dano ao ADN. Ratos Wistar machos e fêmeas foram submetidos ao estresse por contenção por 40 dias. A dieta consistiu de ração padrão e cafeína 0,3 ou 1g/L na água de beber, a vontade, como única fonte de líquido disponível. Controles receberam água da torneira. A ansiedade e o comportamento alimentar foram avaliados, bem como o dano ao ADN (em hipocampo), a lipoperoxidação, o Potencial antioxidante reativo total (TRAP) e a atividade das enzimas antioxidantes Superóxido dismutase (SOD), Glutationa peroxidase (GPx) e Catalase (CAT), no hipocampo, estriado e córtex cerebral. O consumo de cafeína e o estresse crônico aumentaram o comportamento do tipo ansioso, efeito que foi observado apenas nos machos. No comportamento alimentar, a cafeína (0,3g/L e 1g/L) aumentou a latência e diminuiu o consumo de alimento doce (Froot Loops® ) no estado alimentado. Além disso, a cafeína 1g/L levou a um consumo menos intenso de alimento salgado (Cheetos®) pelos ratos no estado de jejum. Tanto a cafeína quanto o estresse aumentaram o dano ao ADN no hipocampo de ratos machos sem haver alteração nas fêmeas. Com relação ao estresse oxidativo, houve interações entre estresse e cafeína, especialmente no córtex, na atividade da SOD e da CAT, uma vez que a cafeína aumentou a atividade destas enzimas nos animais controles e não teve efeito nos estressados. Além disso, o estresse diminuiu a atividade da GPx no córtex e aumentou a atividade da SOD no estriado. Conclui-se que o estresse crônico e o consumo de cafeína levaram a um aumento no comportamento do tipo ansioso em ratos machos. Além disso, a cafeína aumentou a latência e diminuiu o consumo de Froot Loops® em ratos previamente alimentados. Por outro lado, o estresse repetido por contenção induziu um estado de maior susceptibilidade ao estresse oxidativo em algumas estruturas cerebrais devido a atividade alterada das enzimas antioxidantes, enquanto que, a administração crônica de cafeína levou em alguns casos (depende da estrutura) a um aumento na atividade de enzimas antioxidantes, sugerindo um papel neuroprotetor, que depende do estado do sujeito (estressado ou não). / Caffeine is widely consumed in coffee, tea and soft-drinks. Studies show its influence on feeding behavior apparently through slight reduction on calorie ingestion and on anxiety-like behavior, where high doses can induce anxiety states. Besides, it seems to be neuroprotective, and it is possible that part of this effect is due to its antioxidant activity, which is well described in vitro. Caffeine consumption is many times associated to stressfull situations. The exposure to chronic stress leads to biochemical and behavioral changes and it has been suggested that increases free radicals production. The aim of this work is to verify the effect of caffeine consumption and chronic stress on behavioral parameters, anxiety-like-behavior and feeding behavior and on biochemical parameters related to oxidative stress in hippocampus, striatum and brain cortex of rats. Besides, sex specifics differences were verified on anxiety-like behavior and on DNA damage. Wistar rats male and female were submitted to restraint stress for 40 days. The diet was standard chow and caffeine 0.3g/L or 1g/L in the drinking water, ad libitum, as the only source of drinking. Controls received tap water. Anxiety-like-behavior and feeding behavior were evaluated as well as DNA damage (in the hippocampus), lipoperoxidation, Total reactive antioxidant potential (TRAP), and antioxidant enzymes ativities, Superoxide Dismutase (SOD), Glutathione Peroxidase (GPx) and Catalase (CAT) in the hippocampus, striatum and brain cortex. The caffeine consumption and chronic stress increased anxiety-like behavior, effect which was observed only in males. On feeding behavioral, caffeine 0.3g/L and 1g/L increased the latency and decreased the consumption of sweet food (Froot Loops®) on feeding state. Besides, caffeine 1g/L led to a less intense consumption of salty food (Cheetos®), on fasting state. Both caffeine and stress increased the DNA damage in the hippocampus of male rats, without any alteration on females. About oxidative stress, there were interactions between caffeine and stress, specially on cortex, on SOD and CAT activities, once caffeine increased the activity of these enzymes in control animals and had no effect in stressed animals. Furthermore, stress decreased GPx activity in the cortex and increased SOD activity in the estriatum. In conclusion, chronic stress and caffeine consumption led to an increase on anxiety-like behavior in male rats. Besides, caffeine increased the latency and decreased the consumption of Froot Loops® in prefeeding rats. On the other hand, repeated restraint stress induced a state of higher susceptibility to oxidative stress in some structures, considering the altered activities of antioxidant enzymes, while the chronic administration of caffeine, led, in some cases (depending on the structure), to increased activity of antioxidant enzymes, suggesting a possible neuroprotective role, which depends on the subject state (stressed or not).

OLIVEIRA, Daniel Farias de. Aspectos fisiológicos e bioquímicos de plantas de dois cultivares de feijão de corda inoculadas com Bradyrhizobium sp. e submetidas à salinidade. 2013. 90 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2013. / Submitted by Anderson Silva Pereira (anderson.pereiraaa@gmail.com) on 2017-01-03T18:22:05Z No. of bitstreams: 1 2013_dis_dfoliveira.pdf: 2134254 bytes, checksum: 9c74f901746c2de9a8bfae5eeffd2372 (MD5) / Approved for entry into archive by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2017-01-03T18:30:20Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_dis_dfoliveira.pdf: 2134254 bytes, checksum: 9c74f901746c2de9a8bfae5eeffd2372 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-03T18:30:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_dis_dfoliveira.pdf: 2134254 bytes, checksum: 9c74f901746c2de9a8bfae5eeffd2372 (MD5) Previous issue date: 2013 / The use of inoculants containing nitrogen-fixing bacteria, increases annually in cowpea crop in North, Northeast and Midwest regions of Brazil. This work was carried out to evaluate the effects of symbiosis with Bradyrhizobium sp. in plant physiology under salt stress conditions. For this purpose, an experiment was conducted in greenhouse, with two cultivars: Pitiúba (tolerant to salinity) and TVu 2331 (sensitive to salinity), both inoculated with the strain of Bradyrhizobium SEMIA 6461. The experimental design was completely randomized with the following factorial arrangement: 2 (cultivars) x 2 (inoculated and non-inoculated plants) x 2 (stress levels – 0 and 75 mM NaCl). For treatment with rhizobium, seeds were sown in the presence of 1 mL of the culture broth containing the inoculum, the seedlings being maintained for 12 days in this situation. After, inoculated and non-inoculated plants were subjected to salt treatment for 15 days. The results revealed that the bacteria strain reduced the efficiency in nitrogen fixation in cowpea subjected to salt treatment when compared to control treatment. The growth of c plants cowpea was inhibited by salt stress and inoculation with rhizobium was not able to minimize the deleterious effects of salinity, especially in cultivating TVu, which had its biomass most affected by this stress. The levels of toxic ions (Na+ and Cl-) in plants inoculated in relation to non-inoculated showed no significant differences, but the levels of potassium, nitrogen and phosphorus had increases in inoculated plants subjected to salinity. Regarding the levels of organic solutes in saline group plants, we can highlight that: inoculation with bacteria increased carbohydrate levels only in shoots of Pitiúba and roots of TVu; inoculation increased N-amino levels in all parts of both cultivars, except for the roots of Pitiúba; proline levels have increased in the whole plant, except the roots of TVu; protein content invariably increased in all parts of the plants. The net photosynthesis of Pitiúba were not altered in any treatment, but TVu inoculated treatments caused increases in this parameter compared to their respective controls. Excess salt inhibited stomatal conductance in both cultivars, but the maximum quantum yield of PSII did not change in saline treatments, proving that the photosynthetic apparatus of cowpea is tolerant to salinity. Total chlorophyll contents increased in response to salinity, both in inoculated plants as in non-inoculated plants. Oxidative stress induced by salinity led to an increase in the activity of peroxidase and ascorbate peroxidase guaiacol in leaves and roots of both cultivars of nodulated plants. Furthermore, salinity increased activity of the enzyme superoxide dismutase in the roots, despite inoculation have higher enzyme activity in roots of Pitiúba. The increased activity of these enzymes in saline conditions may be related to the inoculation, whereas there was a reduction in lipid peroxidation in plants of both cultivars inoculated and stressed. The salinity negatively affected biomass production of cowpea due to effects caused by the accumulation of toxic ions. Although the nodulation has raised osmoprotectors levels, increased activity of antioxidant enzymes in roots and reduced oxidative damage, there was no significant improvement in growth of the plants of both cultivars studied when subjected to salinity. / O uso de inoculantes, contendo bactérias fixadoras de nitrogênio, aumenta anualmente na cultura do feijão de corda nas regiões Norte, Nordeste e Centro-Oeste do Brasil. Este trabalho foi conduzido com o objetivo de avaliar os efeitos da simbiose com Bradyrhizobium sp. na fisiologia das plantas sob condições de estresse salino. Para isso, conduziu-se um experimento em condições de casa de vegetação, com os cultivares Pitiúba (tolerante à salinidade) e TVu 2331 (sensível à salinidade) inoculados com a estirpe SEMIA 6461 de Bradyrhizobium. O delineamento experimental foi o inteiramente casualizado, com o seguinte arranjo fatorial: 2 (cultivares) x 2 (plantas inoculadas e não inoculadas) x 2 (níveis de estresse – 0 e 75 mM de NaCl). Para o tratamento com o rizóbio, as sementes foram semeadas em presença de 1 mL do caldo de cultura contendo o inóculo, sendo as plântulas mantidas por 12 dias nessa situação. Em seguida, as plantas inoculadas e não inoculadas foram submetidas ao tratamento salino, durante 15 dias. Os resultados mostraram que a estirpe em estudo apresentou eficiência reduzida na fixação biológica do nitrogênio do feijão de corda quando submetido ao tratamento salino em relação ao tratamento respectivo controle. O crescimento das plantas do feijão de corda foi inibido pelo estresse salino e a inoculação com o rizóbio não foi capaz de minimizar os efeitos deletérios da salinidade, principalmente no cultivar TVu, que teve sua biomassa mais afetada por esse estresse. Os teores de íons tóxicos (Na+ e Cl-) nas plantas inoculadas em relação às não inoculadas não apresentaram diferenças significativas, mas os teores de potássio, nitrogênio e fósforo tiveram incrementos nas plantas inoculadas submetidas à salinidade. Em relação aos níveis de solutos orgânicos nas plantas do grupo salino, pode-se destacar que: a inoculação com a bactéria aumentou os níveis de carboidratos somente na parte aérea de Pitiúba e nas raízes de TVu; a inoculação aumentou os teores de N-aminossolúveis em todas as partes de ambos os cultivares, exceto nas raízes de Pitiúba; os teores de prolina aumentaram na planta inteira, exceto nas raízes de TVu; o conteúdo de proteínas aumentou invariavelmente em todas as partes das plantas. A fotossíntese líquida, no Pitiúba, não foi alterada em nenhum dos tratamentos, mas no TVu os tratamentos inoculados provocaram aumentos nesse parâmetro em relação aos seus respectivos controles. O excesso de sal inibiu a condutância estomática em ambos os cultivares, porém o rendimento quântico máximo do PSII não sofreu alteração nos tratamentos salinos, comprovando que o aparato fotossintético do feijão de corda é tolerante à salinidade. Os teores de clorofila total aumentaram em resposta à salinidade, tanto nas plantas inoculadas como nas plantas não inoculadas. O estresse oxidativo induzido pela salinidade levou a um aumento na atividade das enzimas peroxidase do ascorbato e peroxidase do guaiacol, nas folhas e raízes de ambos os cultivares das plantas noduladas. Por outro lado, a salinidade aumentou a atividade da enzima dismutase do superóxido nas raízes, apesar da inoculação ter elevado mais a atividade enzimática nas raízes de Pitiúba. O aumento das atividades dessas enzimas em condições salinas pode estar relacionado com a inoculação, visto que houve redução na peroxidação lipídica nas plantas dos dois cultivares inoculados e estressados. A salinidade afetou negativamente a produção de biomassa do feijão de corda devido aos efeitos causados pelo acúmulo de íons tóxicos. Embora a nodulação tenha elevado os níveis de osmoprotetores, aumentado a atividade das enzimas antioxidativas nas raízes e diminuído os danos oxidativos, não foi observado melhora significativa no crescimento das plantas dos dois cultivares estudados quando submetidos à salinidade.

A transformação genética é uma ferramenta importante para o estudo funcional de genes e obtenção de plantas com novas características agronômicas. A introdução de genes pela engenharia genética requer, para sua expressão otimizada, além de genes de interesse, a utilização de seqüências reguladoras da transcrição (promotores) eficazes. A obtenção de sequências promotoras raiz-específicas seria de grande valia para trabalhos de transformação genética de soja com vista à obtenção de resistência a nematóides e fungos, uma vez que permitiria o direcionamento da expressão de proteínas capazes de combater estes patógenos e outras pragas apenas nos órgãos-alvo do ataque, ou seja, raízes. O presente trabalho relata a caracterização inicial de quatro promotores de soja potencialmente raiz-específicos - GmAQP, GmAS2, GmEXT e GmRB7. A obtenção de raízes transformadas por Agrobacterium rhizogenes é uma ferramenta bastante útil para testar promotores e novos genes de interesse. Para a implementação do método de transformação mediada por A. rhizogenes em nosso laboratório, foram necessárias algumas etapas fundamentais, como a escolha de cultivares mais propícias para a transformação. Neste trabalho, foi identificada a cultivar MG/BR 46 Conquista como a que apresenta maior eficiência de transformação e menor tempo para a produção de raízes transgênicas, dois parâmetros fundamentais para tornar a técnica mais eficiente. A metodologia simples, pouco laboriosa e de rápida obtenção de resultados é essencial para atender as demandas da genômica funcional. O método já está bem estabelecido no laboratório e, além da aplicação na análise de promotores, vem sendo utilizado para testar novos genes candidatos para a transformação da soja e para a localização subcelular de proteínas codificadas pelos genes em estudo. Diversos fatores limitam a maior produtividade da soja, sendo as doenças os mais importantes e difíceis de controlar. Entre os fatores abióticos, a falta de água é responsável pela diminuição da produtividade agrícola, além de restringir as latitudes e os solos onde espécies comercialmente importantes podem ser cultivadas. Com o objetivo de aumentar a resistência a estresses abióticos e bióticos foi introduzido em soja o gene SnOLP, que codifica uma osmotina de Solanum nigrum. Foram obtidas três linhagens transgênicas, todas com uma única cópia do transgene. As análises de gerações segregantes confirmaram a integração estável do transgene. A linhagem B1, proveniente da transformação da cultivar Bragg, apresenta melhores resultados, tanto na resposta a estresses bióticos (fungos) quanto abióticos (seca). Os resultados obtidos no presente estudo mostram que existe potencial para a aplicação do gene SnOLP em estratégias de melhoramento da soja. / Genetic transformation is an important tool for functional studies of genes and generation of plants with new traits. The introduction of genes by genetic engineering requires for its optimal expression, effective transcription regulatory sequences (promoters). Root-specific promoter sequences would be valuable for studies on soybean genetic transformation to obtain nematode and fungal resistance, since they allow the expression of the interest protein in organs usually attacked by diseases - the roots. This thesis reports the initial characterization of four putative root-specific soybean promoters - GmAQP, GmAS2, GmEXT and GmRB7. Transgenic roots transformed by Agrobacterium rhizogenes are useful tool for screening of new promoters and genes of interest. To implement the transformation method mediated by A. rhizogenes in our lab, it was necessary some previous key steps, such as the choice of cultivars more susceptible to the bacteriam infection. MG/BR 46 Conquista cultivar was found to be the most susceptible and can be recommended for A. rhizogenes-mediated transformation experiments. The methodology is simple and fast, essential characteristics to meet the demands of functional genomics. The method is well established in the laboratory and, in addition to analysis of promoters, it has been used to test new genes for soybean transformation and subcellular localization of proteins encoded by the genes under study. Among the many factors that limit soybean yield, diseases are among the most important and difficult to control. Furthermore, the water deficit constrains agricultural productivity, restricting the latitudes and soils where commercially important species can be cultivated. Aiming to obtain increased resistance to abiotic and biotic stresses the osmotin encoding gene (SnOLP) from Solanum nigrum was introduced into soybean cultivars. Three transgenic lines with one transgene copy were obtained. The segregation analysis confirmed the stable integration of SnOLP. In vitro bioassays indicate that B1 transgenic line, derived from Bragg cultivar, was more resistant against economically important pathogenic fungi as well as more tolerant to drought. The results of this study show potential application of SnOLP in strategies for soybean breeding.

SILVA, E. N. Alterações fisiológicas induzidas por estresses abióticos em plantas jovens de pinhão-manso. 2009. 129 f. Tese (Doutorado em Bioquímica) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2009. / Submitted by Francisco Lacerda (lacerda@ufc.br) on 2015-01-19T20:05:45Z No. of bitstreams: 1 2009_tese_ensilva.pdf: 724120 bytes, checksum: d092fa84efeb6334630dedccc71d1f6c (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa(jairo@ufc.br) on 2015-01-19T21:07:30Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_tese_ensilva.pdf: 724120 bytes, checksum: d092fa84efeb6334630dedccc71d1f6c (MD5) / Made available in DSpace on 2015-01-19T21:07:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_tese_ensilva.pdf: 724120 bytes, checksum: d092fa84efeb6334630dedccc71d1f6c (MD5) Previous issue date: 2009 / In this work were studied diverse physiological mechanisms, as the osmotic adjustment, photosynthesis, including gas exchange and chlorophyll fluorescence parameters, as well the oxidative responses in physic nuts submitted to different abiotic stresses as: salinity, drought and high temperature. The first experiment aimed to study the effects of increase of the NaCl concentrations (0, 25, 50, 75 and 100 mM) in the ions accumulate (Na+, Cl- and K+) and some growth variables, as well evaluate the water state and the principals solutes (organic and inorganic) involved on the osmotic adjustment of physic nuts plants under this stressful condition. Physic nuts plants showed sensibility to salt stress, presenting a reduction by 50% in dry matter from by 47 mM of NaCl concentration during 15-d. This sensibility should be due the leaf Na+ and Cl- high accumulation, associated a strong reduction in the K+concentration, induced by high Na+ content. On the other hand, physic nuts plants were able osmotic adjust to salinity due a severe decrease on the osmotic potential and increase of leaf water state, principally in the higher NaCl levels. Of the solutes studied, was observed that salt ions (Na+ and Cl-) contributed with the most of the osmotic adjustment, while that the K+contribution was decreased strongly by NaCl. The glycinebetaine compared to proline was more important to the osmotic adjustment of physic nuts leaves, as in the absence as in presence of different NaCl levels in the nutrient solution. The second experiment evaluated the resistance of photosynthetic apparatus of physic nuts plants submitted to different time of exposure (7-d and 14-d of treatment and 3-d of recovery) to salt stress (100 mM of NaCl).The changes caused on photochemistry activity and leaf gas exchange were evaluate by Na+ and Cl- accumulation and decrease of K+/Na+ ratio in the leaves. After 7-d of treatment was observed a major action of osmotic effects. However, after 14-d of treatment, the ionic effects caused by Na+ and Cl- excessive accumulation and by K+/Na+ ratio strong reduction in the leaves, caused permanent damages on the photosynthesis of physic nuts plants due as the stomatal limitations as non-stomatal ones. The third experiment aimed to study the comparative effects between the salt stress (50 mM of NaCl) and water stress (induced for xv PEG 6000), both with osmotic potential of –0.22 MPa on the photosynthesis, water relations and growth of physic nuts plants. T e water stress effects induced for PEG in the leaf growth, electrolyte leakage and leaf gas exchange were more deleterious than by NaCl ones. In the both stresses was observed decrease in the leaf CO2 assimilation due the stomatal and nonstomatal limitations. However, the chlorophyll fluorescence parameters did not affect. The fourth experiment aimed to evaluate the relative contribution of organic and inorganic solutes on the osmotic adjustment of leaves and roots physic nuts plants in different water restriction levels. Of the solutes studied, the K+ and soluble sugar were the most involved in the osmotic adjustment as in the leaves as in roots. Others solutes as, Na+, Cl-, total amino acids and glycibetaine, also presented a effective role in the reduction of osmotic potential in both organs. On the other hand, the leaf proline content, although has increased significantly, was not sufficient to promote an effective participation of this amino acid in the osmotic adjustment of physic nuts plants. The same experiment aimed to observe the isolated and combined effects of water stress and high temperature on the photosynthesis and evaluate the oxidative defenses system in physic nuts plants. The photosynthetic apparatus was more sensitive to water stress than heat ones, been that the combination of them caused deleterious effects yet large in this complex. Additionally, the oxidative damages also were more marked in the combined stress. In general, the data shown that physic nuts plants, although present ability to adjust osmotically to salinity and drought, have their photosynthetic apparatus very affected in this stressful conditions. Even as, the defense system against oxidative damages appears has not been efficient in plants exposure at the drought and heat isolated and combined stresses.