Submitted by ENDRIGO ADONIS BRAGA DE ARAUJO null (adonis.tecvet@yahoo.com.br) on 2016-04-27T02:07:05Z No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_BHT_Araujo, EAB.pdf: 638286 bytes, checksum: 01feb4c9fddef023795b0f62318b20f2 (MD5) / Approved for entry into archive by Felipe Augusto Arakaki (arakaki@reitoria.unesp.br) on 2016-04-28T16:16:58Z (GMT) No. of bitstreams: 1 araujo_eab_me_bot.pdf: 638286 bytes, checksum: 01feb4c9fddef023795b0f62318b20f2 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-28T16:16:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 araujo_eab_me_bot.pdf: 638286 bytes, checksum: 01feb4c9fddef023795b0f62318b20f2 (MD5) Previous issue date: 2016-02-26 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O processo de criopreservação acarreta estresse oxidativo à célula espermática e a adição de antioxidantes aos meios de refrigeração e congelação de sêmen pode auxiliar na proteção dos espermatozoides contra o dano induzido pelas espécies reativas de oxigênio (ERO), incluindo perda da motilidade de forma irreversível, peroxidação lipídica e fragmentação do DNA, interferindo na capacidade de fertilização do espermatozoide. Dentre os diferentes antioxidantes, o Butil-hidroxitolueno (BHT) é um análogo sintético da vitamina E, cujo efeito protetor é atribuído a dois mecanismos: o aumento da fluidez da membrana plasmática após a incorporação do antioxidante, e o segundo por conter a cascata de peroxidação lipídica pela conversão de peroxil em hidroperóxido lipídico. O BHT foi testado em diversas espécies demonstrando melhora na motilidade, integridade de membrana plasmática e viabilidade espermática; porém, na espécie equina, a inclusão de BHT em diluentes para criopreservação de sêmen necessita ser melhor avaliada. Deste modo, o objetivo deste trabalho foi avaliar a influência do BHT nas células espermáticas de equinos submetidas à criopreservação e sua capacidade de conter a peroxidação lipídica e produção de espécies reativas de oxigênio quando os espermatozoides foram submetidos a estresse. / The process of cryopreservation brings out oxidative stress to spermatic cell and the addition antioxidant of into cooling and freezing semen extenders could assist in protection of spermatozoa against the damage induced by reactive oxygen species (ROS), including irreversible loss in motility, lipid peroxidation and DNA fragmentation, interfering with the fertilizing capacity of sperm. Among different antioxidants, the butylated hydroxytoluene (BHT) is a synthetic analogue of vitamin E, whose protective effect is attributed to two mechanisms: the increase in sperm membrane fluidity after the addition of antioxidant, and the lipid peroxidation cascade for converting peroxy radicals into lipid hydroperoxides. BHT was tested in different species and the results include improvement in motility, spermatic membrane integrity and sperm viability. However, the addition of BHT in horse semen extenders for cryopreservation purposes demands further research. Thereby, the aims of this study were (1) to evaluate the influence of BHT on equine spermatic cells submitted to cryopreservation and (2) the capacity of BHT to contain the lipid peroxidation and the production of reactive species of oxygen when sperm cells were submitted to stress. / FAPESP: 2014/00175-8

Orientador: Frederico Ozanam Papa / Resumo: O processo de criopreservação acarreta estresse oxidativo à célula espermática e a adição de antioxidantes aos meios de refrigeração e congelação de sêmen pode auxiliar na proteção dos espermatozoides contra o dano induzido pelas espécies reativas de oxigênio (ERO), incluindo perda da motilidade de forma irreversível, peroxidação lipídica e fragmentação do DNA, interferindo na capacidade de fertilização do espermatozoide. Dentre os diferentes antioxidantes, o Butil-hidroxitolueno (BHT) é um análogo sintético da vitamina E, cujo efeito protetor é atribuído a dois mecanismos: o aumento da fluidez da membrana plasmática após a incorporação do antioxidante, e o segundo por conter a cascata de peroxidação lipídica pela conversão de peroxil em hidroperóxido lipídico. O BHT foi testado em diversas espécies demonstrando melhora na motilidade, integridade de membrana plasmática e viabilidade espermática; porém, na espécie equina, a inclusão de BHT em diluentes para criopreservação de sêmen necessita ser melhor avaliada. Deste modo, o objetivo deste trabalho foi avaliar a influência do BHT nas células espermáticas de equinos submetidas à criopreservação e sua capacidade de conter a peroxidação lipídica e produção de espécies reativas de oxigênio quando os espermatozoides foram submetidos a estresse. / Abstract: The process of cryopreservation brings out oxidative stress to spermatic cell and the addition antioxidant of into cooling and freezing semen extenders could assist in protection of spermatozoa against the damage induced by reactive oxygen species (ROS), including irreversible loss in motility, lipid peroxidation and DNA fragmentation, interfering with the fertilizing capacity of sperm. Among different antioxidants, the butylated hydroxytoluene (BHT) is a synthetic analogue of vitamin E, whose protective effect is attributed to two mechanisms: the increase in sperm membrane fluidity after the addition of antioxidant, and the lipid peroxidation cascade for converting peroxy radicals into lipid hydroperoxides. BHT was tested in different species and the results include improvement in motility, spermatic membrane integrity and sperm viability. However, the addition of BHT in horse semen extenders for cryopreservation purposes demands further research. Thereby, the aims of this study were (1) to evaluate the influence of BHT on equine spermatic cells submitted to cryopreservation and (2) the capacity of BHT to contain the lipid peroxidation and the production of reactive species of oxygen when sperm cells were submitted to stress. / Mestre

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:47:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 273286 bytes, checksum: 9542fd937bde4847604c5b52aa572841 (MD5) Previous issue date: 2013-02-26 / Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / The maintenance of naturalized swine breeds is very important for the Brazilianpork production industry, due to the potential source of new genetic variants. The Piau breed is considered one of the best and the most important Brazilian domestic naturalized swine breeds. Thus, research towards developing protocols for freezing semen is essential in order to create germplasm banks and protect the endangered swine breeds. Protocols for boar semen cryopreservation require the centrifugation of semen in order to separate sperm cells from the seminal plasma, nevertheless it has not been main focus on many studies. The aim on this study was to evaluate the effect of centrifugation and freezing curve in cryopreservation protocol on after thawing sperm viability of Piau swine breed (Sus scrofa), through assessment in vitro tests. Six ejaculates from five Piau boars were used, with ages ranging from 1.5 to 5.0 years, approved by andrologic examination, 30 samples in total. The semen collections were performed using the method of stimulation with a gloved hand with the aid of a dummy or a sow in natural estrus. Two centrifugations (800 G for ten minutes and 2400 G for three minutes) and two freezing curves (with conventional nitrogen vapor- freezing 1 and controlled by a programmed freezing machine- freezing 2) were tested. So the treatments were divided into M3- centrifugation at 2400 G for 3 minutes and freezing 2; M10- centrifugation at 800 G for 10 minutes and freezing 2; R3-centrifugation at 2400 G for 3 minutes and freezing 1; R10- centrifugation 800 for 10 minutes and freezing 1. After thawing, the averages recorded for total sperm motility and vigor of semen were 44.0 ± 10.3 and 3.1 ± 0.4; 44.3 ± 7.7 and 3.0 ± 0.3; 39.2 ± 10.2 and 2.9 ± 0.4; 38.0 ± 9.2 and 2.9 ± 0.4 respectively for treatments M3, M10, R3 and R10, with no difference between the groups (p> 0.05). The mean values in the different treatments did not differ regarding supravital test (39.9 ± 7.9; 40.1 ± 8.1; 37.3 ± 7.0; 36.5 ± 6.8, respectively to M3, M10, R3 and R10), hypoosmotic, the number of sperm bound perivitelline membrane of chicken egg yolk and morphology (p> 0.05). No interaction between freezing curve and centrifugation force was detected, hence the further individual analysis. In the present study it was observed that both the curve and the freezing spin regime influence on after thawing sperm quality, and shorter centrifugation periods and freezing rates decrease with temperature controlled by machine are the most suitable to decrease sperm injuries. / A manutenção das chamadas raças naturalizadas de suínos é muito importante, pois constituem fontes potenciais de novas variantes genéticas de extrema importância para a suinocultura nacional. A raça Piau é considerada uma das melhores e mais importantes raças naturalizadas brasileiras. Desta forma, a pesquisa em desenvolvimento de protocolos de congelamento de sêmen é imprescindível para formação de bancos de germoplasma e proteção de raças suínas em risco de extinção. Protocolos de criopreservação de sêmen suíno necessitam de centrifugação para separar os espermatozóides do plasma seminal, mas essa não tem sido muito enfocada nos estudos. O objetivo no presente estudo foi avaliar o efeito do tempo de centrifugação e da curva de congelamento em protocolo de criopreservação sobre a viabilidade espermática pós-descongelamento de suínos da raça Piau (Sus scrofa), por meio de testes de avaliação in vitro. Foram utilizados seis ejaculados de cinco varrões da raça Piau, com idades variando de 1,5 a 5,0 anos, aprovados por meio de exame andrológico, totalizando 30 amostras. As coletas de sêmen foram realizadas utilizando o método da estimulação com a mão enluvada com auxílio de um manequim ou uma fêmea em estro natural. Foram testadas duas centrifugações (800 G por dez minutos e 2400 G por três minutos) e duas curvas de congelamento (convencional com vapor de nitrogênio - congelamento 1 e controlada por uma máquina de congelamento programada- congelamento 2). Dessa forma os tratamentos foram divididos em M3-Centrifugação à 2400 G por 3 minutos e congelamento 2; M10- Centrifugação à 800 G por 10 minutos e congelamento 2; R3-Centrifugação à 2400 G por 3 minutos e congelamento 1; R10-Centrifugação à 800 G por 10 minutos e congelamento 1. Após o descongelamento, as médias registradas para motilidade espermática total e vigor do sêmen foram 44,0±10,3 e 3,1±0,4; 44,3±7,7 e 3,0±0,3; 39,2±10,2 e 2,9±0,4; 38,0±9,2 e 2,9±0,4 respectivamente para os tratamentos M3, M10, R3 e R10, não havendo diferença entre os mesmos (p>0,05). Os valores médios nos diferentes tratamentos não apresentaram diferença em relação aos testes supravital (39,9±7,9; 40,1±8,1; 37,3±7,0; 36,5±6,8; respectivamente para M3, M10, R3e R10), hiposmótico, número de espermatozóides ligados a membrana perivitelínica da gema de ovo de galinha e morfologia espermática (p>0,05). Não houve interação entre curva de congelamento e centrifugação, sendo então analisadas de forma independente. No presente estudo foi observado que tanto a curva de congelamento quanto o regime de centrifugação influenciam na qualidade espermática pós-descongelamento, sendo que centrifugações com tempos mais curtos e curvas de congelamento com queda de temperatura controlada por máquina são as mais indicadas para mininizar as injúrias espermáticas.

A motilidade espermática depende do consumo de energia. Em algumas espécies, a mitocôndria espermática tem um importante papel na produção de energia para o batimento flagelar. A irradiação com Laser de baixa intensidade aumenta a produção de energia funcionando como uma ferramenta de biomodulação. O objetivo deste estudo foi analisar o efeito da irradiação contínua de 650 nm de comprimento de onda de Laser Diodo, com dose de 6 J/cm2 por 120s, na motilidade, integridade das membranas plasmática e acrossomal e no potencial de membrana mitocondrial em espermatozóides in natura e criopreservados. Cinco ejaculados foram obtidos de cinco garanhões (n=25). O sêmen foi acondicionado em palhetas de 0,5mL com 200x106 cells/mL em diluidor Botu-CrioTM (Biotech-Botucatu-Ltda/ME, Botucatu, Brasil) e congelado utilizando o sistema automático programável (TK3000®, TK Tecnologia em Congelação_Ltda, Uberaba, Brasil). As amostras in natura foram divididas em dois grupos: espermatozóides tratados COM LASER e espermatozóides não tratados - SEM LASER. As amostras congeladas foram divididas em três grupos: espermatozóides tratados COM LASER antes da congelação; espermatozóides tratados COM LASER depois da congelação e espermatozóides criopreservados não tratados SEM LASER. As amostras criopreservadas foram analisadas imediatamente após a descongelação (tempo zero) e duas horas após a descongelação (tempo 2). A motilidade foi avaliada pelo sistema de análise espermática computadorizada (CASA, Ivos-Ultimate of Hamilton Thorne Biosciences), a integridade das membranas plasmática e acrossomal e o potencial de membrana mitocondrial foram avaliados pela técnica de citometria de fluxo (FACSaria-Beckton-Dickeson, San Jose, USA). Os dados foram analisados pelo programa SAS, com nível de significância de 5%. A freqüência de batimentos flagelar (BCF) foi alta (P<0,05) para o grupo de espermatozóides in natura tratados COM LASER (34,8 ± 0,7%) quando comparado com o grupo de espermatozóides in natura não tratados SEM LASER (33,4 ± 0,8%). No tempo zero, o potencial de membrana mitocondrial foi baixo no grupo de espermatozóides tratados COM LASER antes da congelação (40,7 ± 1,5%) quando comparados com o grupo de espermatozóides congelados não tratados - SEM LASER (47,4 ± 2,4%) (P<0,05). Duas horas após a descongelação, as membranas plasmática e acrossomal apresentavam maior porcentagem de integridade no grupo de espermatozóides tratados COM LASER antes da congelação (8,3 ± 0,7%) do que no grupo congelado não tratados - SEM LASER (6,2 ± 0,6%) (P<0,05). O grupo de espermatozóides tratados COM LASER depois da congelação não diferiu (P>0,05) dos outros grupos do tempo 2, porém no tempo zero a porcentagem de espermatozóides com motilidade progressiva foi baixa (2,0 ± 0,3%) e diferente (P<0,05) dos outros grupos (6,5 ± 1,3 nos espermatozóides tratados COM LASER antes da congelação e 5,5 ± 1,1% nos espermatozóides congelados não tratados - SEM LASER). Estes resultados indicam que a irradiação de 650 nm de comprimento de onda aumenta a freqüência de batimentos flagelar no sêmen fresco e confere melhor proteção à membrana plasmática e acrossomal ao longo do tempo (após 2h de incubação). Os resultados com sêmen congelado permitem concluir que o melhor momento para a aplicação do laser é antes da criopreservação. Novos estudos com diferentes comprimentos de onda, potência do raio e dosagem devem ser conduzidos para se obter um melhor protocolo visando aprimorar a criopreservação do sêmen eqüino. / Sperm motility depends on energy consumption. In some species sperm mitochondria play an important role in the production of energy for tail activity. Low-level laser irradiation increases this production as a modulation tool. The objective of this study was to analyze the effect of a continuous 650 nm wavelength diode laser irradiation, with dose 6 J/cm2 for 120s, in the motility, plasma and acrosomal membrane integrity and mitochondrial membrane potential in fresh and frozen equine spermatozoa. Five ejaculates were obtained from five stallions (n=25). Semen was packaged into 0.5mL straws with 200x106 cells/mL in a Botu-CrioTM (Biotech-Botucatu-Ltda/ME, Botucatu, Brazil) and frozen by automated technique using a programmed machine (TK3000®, TK Tecnologia em Congelação-Ltda, Uberaba, Brazil). Fresh samples were divided in two groups: spermatozoa treated with laser and without laser (non treated spermatozoa), and frozen samples in three groups: spermatozoa treated with laser before freezing; spermatozoa treated with laser after thawing and without laser (cryopreserved spermatozoa). Cryopreserved samples were analyzed immediately after thawing (time 0) and two hours after thawing (time 2). Motility was evaluated by computer assisted sperm analysis (CASA, Ivos-Ultimate of Hamilton Thorne Biosciences), plasma and acrosomal membrane integrity and mitochondrial membrane potential were evaluated by flow cytometry (FACSaria-Beckton-Dickeson, San Jose, USA). The data were analyzed by the SAS program, at a 5% level. Beat cross frequency (BCF) test was higher (p<0.05) for fresh semen group treated with laser (34.8 ± 0.7%) as compared to non treated group (without Laser - 33.4 ± 0.8%). At time zero, mitochondrial membrane potential was lower in laser treatment before freezing group (40.7 ± 1.5%); compared to without laser treatment group (cryopreserved spermatozoa - 47.4 ± 2.4%) (P<0.05). Two hours after thawing, plasma and acrosomal integrity was higher (P<0.05) in the group were spermatozoa were treated with laser before freezing (8.3 ± 0.7%) compared with the group without laser treatment (cryopreserved spermatozoa) (6.2 ± 0.6%). The group treated with laser after thawing didn´t show any difference (P>0.05) compared to the others groups at this period. However, at time 0 percentage of progressive motility was lower (2.0 ± 0.3%) (P<0.05) than groups treated with laser before freezing (6.5 ± 1.3%) and cryopreserved without laser (5.5 ± 1.1%). These results indicated that the irradiation of 650 nm wavelength diode laser improves beat cross frequency in the fresh semen and support a long term (2 hours) protection to plasma and acrosomal membrane of equine spermatozoa. Based on the results of frozen semen, the best moment for laser application is before cryopreservation protocol. New studies with different diode laser wavelength, different power and energy doses should be driven in order to improve stallion semen cryopreservation.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:47:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1144474 bytes, checksum: 90be17c3551f2f4eb67e6564c42f0527 (MD5) Previous issue date: 2012-03-07 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The aim of this study was to elucidate aspects of asinine behavior from the description of various collections using an artificial vagina and relate this behavior with the seminal parameters. We evaluated also the availability of the formulation of the diluent T2-94 plus dimethylformamide in the protection of sperm cells during cryopreservation of semen from the Pêga breed donkeys; examined the effect of the reintroduction of seminal plasma (SP) after thawing in protection against osmotic stress of that semen, and also the effect of dilution with Botu-Semen ® (BTU), evaluating the effects on parameters of sperm viability assessments by "in vitro", described in Chapter 2. Used in this study were three Pêga donkeys. At first, the samples were taken only for sexual behavior of animals: Number of Flehmen Reflexes (FR), numbers of mounts without erection (MWE) and reaction time (RT), besides the evaluation of fresh semen is not diluted. The results showed that the animals were, on average, FR 3.9, MWE 1.4 and finishing the service about 24.8 min. The mean ejaculate volume was 53 mL. The motility was 77%, and the force of 3.7 ± 0.3. The sperm concentration ranged from 683 to 710 million sperm per mL of semen ejaculated. In morphology, the average was 12% of viable cells in the ejaculate. It was found that the greater the reaction time and the number of mounts without erection, the greater number of ejaculations in the presence of gel. The best adequacy of management to be employed under the conditions of the study, the proportion depends on knowledge about the sexual behavior of animals used. In a second step, semen was collected from those animals intended for freezing, using the diluent T2-94, plus the cryoprotectant dimethyl formamide. On thawing, the samples were diluted SP or BTU and observed for two hours, during the heat resistance test (HRT). Samples were removed for evaluation of frozen-thawed semen, the morphology and hypoosmotic stress test in three treatments (control, SP and BTU). The results showed that the motility was greater in SP treatment (55.9%) compared with the control group (50.6%). The mean of the spermatic was 3.4 with addition of SP and BTU after freezing. The number of cells reactive to supravital test, and the percentage of total defects observed in sperm morphology did not differ between treatments. In hypoosmotic test, the number of reactive cells was higher in treatment with the addition of PS (43.5%). During the HRT, motility was kept higher within 2 hours after thawing with addition of PS or with addition of BTU (25.2 ± 10.6 and 23.4 ± 13.1, respectively). The same occurred with the spermatic in T4 showed that 2.8 ± 0.4 in the treatment with the addition of SP, and 2.4 ± 0.6 with the addition of BTU. The evaluation means 94 + T2-dimethylformamide to asses semen were positive, showing be able to preserve sperm motility after cryopreservation. The reintroduction of SP showed improvement in semen parameters and remained seminal acceptable standard tests "in vitro". / O objetivo do presente estudo foi observar aspectos do comportamento asinino a partir da descrição de várias coletas realizadas com vagina artificial e relacionar esse comportamento com os parâmetros seminais. Avaliou-se, ainda, a eficácia da formulação do diluente T2-94 acrescido de dimetilformamida na proteção das células espermáticas durante a criopreservação do sêmen de jumentos da raça Pêga; analisou-se o efeito da reintrodução do plasma seminal (PS) após o descongelamento na proteção contra o estresse osmótico desse mesmo sêmen; e também o efeito da diluição com Botu-Sêmen® (BTU), avaliando-se os efeitos nos parâmetros de viabilidade espermática mediante as avaliações in vitro , descritas no capítulo 2. Foram utilizados neste estudo três jumentos da raça Pêga. Em um primeiro momento, as coletas foram realizadas somente para observação do comportamento sexual dos animais: Número de Reflexos de Flehmen (RF), Números de montas sem ereção (MSE) e Tempo de reação (TR), além da avaliação do sêmen fresco não diluído. Como resultados, observou-se que os animais faziam, em média, 3,9 RF, 1,4 MSE e finalizavam o serviço em torno de 24,8 min. A média do volume ejaculado foi 53 mL. A motilidade média foi de 77%, e o vigor de 3,7±0,3. A concentração espermática variou de 683 a 710 milhões de espermatozoides por mL de sêmen ejaculado. Na morfologia, a média foi de 12% de células inviáveis no ejaculado. Concluiu-se que, quanto maior o tempo de reação e o número de montas sem ereção, maior a quantidade de ejaculados com a presença de gel. A melhor adequação do manejo a ser empregado, nas condições do estudo, depende proporcionalmente do conhecimento sobre o comportamento sexual dos animais utilizados. Em um segundo momento, sêmen coletado dos referidos animais foi destinado ao congelamento, utilizando-se o diluente T2-94, acrescido do crioprotetor dimetilformamida. No descongelamento, as amostras foram diluídas em PS ou BTU e observadas por duas horas, durante o teste de termorresistência (TTR). Foram retiradas amostras para avaliação, desse sêmen descongelado, da morfologia e para teste de estresse hiposmótico em três tratamentos (controle, com PS e com BTU). Os resultados mostraram que a motilidade foi superior no tratamento com PS (55,9%), quando comparada com o grupo controle (50,6%). Já a média do vigor espermático foi de 3,4 nos tratamentos com adição de PS e de BTU pós-congelamento. O número de células reativas ao teste supravital, e a porcentagem de defeitos totais observados na morfologia espermática, não diferiram entre os tratamentos. No Teste Hiposmótico, o número de células reativas foi superior no tratamento com adição de PS (43,5%). Durante o TTR, a motilidade manteve-se maior até duas horas após o descongelamento nos tratamentos com adição de PS ou com adição de BTU (25,2±10,6 e 23,4±13,1, respectivamente). O mesmo ocorreu com o vigor espermático que no tempo 90 min apresentava 2,8±0,4 no tratamento com adição de PS, e 2,4±0,6 com adição de BTU. A avaliação do meio T2-94 acrescido de dimetilformamida para sêmen de jumentos foi positiva, demonstrando ser capaz de preservar motilidade dos espermatozoides após a criopreservação. A reintrodução do PS mostrou melhora nos parâmetros seminais e manteve um padrão seminal aceitável nos testes in vitro .

A motilidade espermática depende do consumo de energia. Em algumas espécies, a mitocôndria espermática tem um importante papel na produção de energia para o batimento flagelar. A irradiação com Laser de baixa intensidade aumenta a produção de energia funcionando como uma ferramenta de biomodulação. O objetivo deste estudo foi analisar o efeito da irradiação contínua de 650 nm de comprimento de onda de Laser Diodo, com dose de 6 J/cm2 por 120s, na motilidade, integridade das membranas plasmática e acrossomal e no potencial de membrana mitocondrial em espermatozóides in natura e criopreservados. Cinco ejaculados foram obtidos de cinco garanhões (n=25). O sêmen foi acondicionado em palhetas de 0,5mL com 200x106 cells/mL em diluidor Botu-CrioTM (Biotech-Botucatu-Ltda/ME, Botucatu, Brasil) e congelado utilizando o sistema automático programável (TK3000®, TK Tecnologia em Congelação_Ltda, Uberaba, Brasil). As amostras in natura foram divididas em dois grupos: espermatozóides tratados COM LASER e espermatozóides não tratados - SEM LASER. As amostras congeladas foram divididas em três grupos: espermatozóides tratados COM LASER antes da congelação; espermatozóides tratados COM LASER depois da congelação e espermatozóides criopreservados não tratados SEM LASER. As amostras criopreservadas foram analisadas imediatamente após a descongelação (tempo zero) e duas horas após a descongelação (tempo 2). A motilidade foi avaliada pelo sistema de análise espermática computadorizada (CASA, Ivos-Ultimate of Hamilton Thorne Biosciences), a integridade das membranas plasmática e acrossomal e o potencial de membrana mitocondrial foram avaliados pela técnica de citometria de fluxo (FACSaria-Beckton-Dickeson, San Jose, USA). Os dados foram analisados pelo programa SAS, com nível de significância de 5%. A freqüência de batimentos flagelar (BCF) foi alta (P<0,05) para o grupo de espermatozóides in natura tratados COM LASER (34,8 ± 0,7%) quando comparado com o grupo de espermatozóides in natura não tratados SEM LASER (33,4 ± 0,8%). No tempo zero, o potencial de membrana mitocondrial foi baixo no grupo de espermatozóides tratados COM LASER antes da congelação (40,7 ± 1,5%) quando comparados com o grupo de espermatozóides congelados não tratados - SEM LASER (47,4 ± 2,4%) (P<0,05). Duas horas após a descongelação, as membranas plasmática e acrossomal apresentavam maior porcentagem de integridade no grupo de espermatozóides tratados COM LASER antes da congelação (8,3 ± 0,7%) do que no grupo congelado não tratados - SEM LASER (6,2 ± 0,6%) (P<0,05). O grupo de espermatozóides tratados COM LASER depois da congelação não diferiu (P>0,05) dos outros grupos do tempo 2, porém no tempo zero a porcentagem de espermatozóides com motilidade progressiva foi baixa (2,0 ± 0,3%) e diferente (P<0,05) dos outros grupos (6,5 ± 1,3 nos espermatozóides tratados COM LASER antes da congelação e 5,5 ± 1,1% nos espermatozóides congelados não tratados - SEM LASER). Estes resultados indicam que a irradiação de 650 nm de comprimento de onda aumenta a freqüência de batimentos flagelar no sêmen fresco e confere melhor proteção à membrana plasmática e acrossomal ao longo do tempo (após 2h de incubação). Os resultados com sêmen congelado permitem concluir que o melhor momento para a aplicação do laser é antes da criopreservação. Novos estudos com diferentes comprimentos de onda, potência do raio e dosagem devem ser conduzidos para se obter um melhor protocolo visando aprimorar a criopreservação do sêmen eqüino. / Sperm motility depends on energy consumption. In some species sperm mitochondria play an important role in the production of energy for tail activity. Low-level laser irradiation increases this production as a modulation tool. The objective of this study was to analyze the effect of a continuous 650 nm wavelength diode laser irradiation, with dose 6 J/cm2 for 120s, in the motility, plasma and acrosomal membrane integrity and mitochondrial membrane potential in fresh and frozen equine spermatozoa. Five ejaculates were obtained from five stallions (n=25). Semen was packaged into 0.5mL straws with 200x106 cells/mL in a Botu-CrioTM (Biotech-Botucatu-Ltda/ME, Botucatu, Brazil) and frozen by automated technique using a programmed machine (TK3000®, TK Tecnologia em Congelação-Ltda, Uberaba, Brazil). Fresh samples were divided in two groups: spermatozoa treated with laser and without laser (non treated spermatozoa), and frozen samples in three groups: spermatozoa treated with laser before freezing; spermatozoa treated with laser after thawing and without laser (cryopreserved spermatozoa). Cryopreserved samples were analyzed immediately after thawing (time 0) and two hours after thawing (time 2). Motility was evaluated by computer assisted sperm analysis (CASA, Ivos-Ultimate of Hamilton Thorne Biosciences), plasma and acrosomal membrane integrity and mitochondrial membrane potential were evaluated by flow cytometry (FACSaria-Beckton-Dickeson, San Jose, USA). The data were analyzed by the SAS program, at a 5% level. Beat cross frequency (BCF) test was higher (p<0.05) for fresh semen group treated with laser (34.8 ± 0.7%) as compared to non treated group (without Laser - 33.4 ± 0.8%). At time zero, mitochondrial membrane potential was lower in laser treatment before freezing group (40.7 ± 1.5%); compared to without laser treatment group (cryopreserved spermatozoa - 47.4 ± 2.4%) (P<0.05). Two hours after thawing, plasma and acrosomal integrity was higher (P<0.05) in the group were spermatozoa were treated with laser before freezing (8.3 ± 0.7%) compared with the group without laser treatment (cryopreserved spermatozoa) (6.2 ± 0.6%). The group treated with laser after thawing didn´t show any difference (P>0.05) compared to the others groups at this period. However, at time 0 percentage of progressive motility was lower (2.0 ± 0.3%) (P<0.05) than groups treated with laser before freezing (6.5 ± 1.3%) and cryopreserved without laser (5.5 ± 1.1%). These results indicated that the irradiation of 650 nm wavelength diode laser improves beat cross frequency in the fresh semen and support a long term (2 hours) protection to plasma and acrosomal membrane of equine spermatozoa. Based on the results of frozen semen, the best moment for laser application is before cryopreservation protocol. New studies with different diode laser wavelength, different power and energy doses should be driven in order to improve stallion semen cryopreservation.