A hipóxia é capaz de alterar muitos mecanismos bioquímicos nas células endoteliais. Dentre eles, a indução da expressão endotelial de moléculas de adesão, como o fator de von Willebrand (FVW) que, em resposta ao estímulo, é secretado em sua forma mais ativa na interação com as plaquetas, o que pode resultar em trombose. Nas condições fisiológicas, o padrão multimérico do FVW no plasma é essencialmente determinado pela ADAMTS-13 (uma desintegrina e metaloproteinase com domínios trombospondina). Este estudo teve como objetivo verificar se a atividade da enzima ADAMTS-13, assim como as características do FVW relacionáveis a ela, poderiam estar alteradas na presença de hipoxemia comparativamente à condição de oxigenação normal. Este estudo longitudinal envolveu 56 pacientes portadores de cardiopatias congênitas cianogênicas, em idades entre um e sete anos, candidatos ao tratamento cirúrgico. Os pacientes foram avaliados no pré-cirúrgico (basal), no pós-operatório imediato (pós 48 horas) e após 30 dias de cirurgia, e foram divididos em dois grupos (A e B) baseado na saturação periférica de oxigênio (SpO2) no momento pós 30 dias. Foram determinados o antígeno do FVW e a análise das suas subunidades, a atividade da ADAMTS-13 e a presença de inibidores da ADAMTS-13. Os pacientes de ambos os grupos apresentaram aumento significante da SpO2, da concentração antigênica do FVW e da atividade da ADAMTS-13 nos momentos pós 48 horas e pós 30 dias em comparação com o momento pré (basal). As densidades normalizadas da subunidade principal do FVW (225 kDa) e do fragmento de 176 kDa apresentaram tendência ao aumento nos momentos pós 48 horas e pós 30 dias nos dois grupos. A razão entre a atividade da ADAMTS-13 e o FVW estava menor do que 1 no momento pós 48 horas, indicando consumo da enzima; entretanto, no momento pós 30 dias a razão fica 1:1, e o FVW se aproxima dos valores de referência. Verificamos ainda que 29% destes pacientes apresentaram inibidores contra a ADAMTS-13 no momento pré-operatório. Ainda explorando as variáveis SpO2, FVW:Ag, atividade da ADAMTS-13 e a composição das subunidades do FVW, foi feito um estudo de correlação linear entre estas variáveis. Observamos uma baixa correlação entre a enzima ADAMTS-13 e o FVW:Ag, e da enzima com os fragmentos do FVW de 176 e 140 kDa, principalmente no grupo B. No grupo A, esta correlação no momento pós 48 horas mostrou tendência a ser negativa. A maioria dos pacientes apresentou melhoras na saturação periférica de oxigênio. O aumento das variáveis estudadas no pós-operatório imediato pode ter ocorrido em função da cirurgia, que provavelmente ocasionou um quadro de lesão endotelial com inflamação, indicando que pode existir um equilíbrio entre o FVW e a ADAMTS-13 em níveis fisiológicos. Entretanto, este equilíbrio pode ser quebrado quando ocorre aumento do FVW, provavelmente por consumo da enzima. Parece-nos, portanto, que a ADAMTS-13 pode funcionar como um mecanismo de proteção a estes pacientes com tendência à trombose / Hypoxia has been shown to alter several biochemical mechanisms in endothelial cells. In addition, hypoxia induces the endothelial expression of adhesion molecules, including von Willebrand factor (VWF). Increased release of high-molecular-weight VWF multimers is associated with higher risk for thrombotic events. In physiological conditions, the multimeric pattern of plasma VWF is essentially determined by the action of ADAMTS-13 (a desintegrin and metalloprotease with thrombospondin type 1 domains). The aim of this study was to investigate if ADAMTS-13 activity and VWF subunit fragments were altered by hypoxia in cyanotic congenital heart disease. Fiftysix patients (age 1 to 7 years) with cyanotic congenital heart disease admitted to the Heart Institute for heart surgery were included in this longitudinal study. Patients were evaluated before (baseline) corrective surgery, postoperative 48 hours and postoperative 30 days. Patients were classified in two groups (A and B) based on the peripheral oxygen saturation after 30 days surgery. VWF antigenic concentration, VWF subunit composition, ADAMTS-13 activity and presence of ADAMTS-13 inhibitors were determined. Peripheral oxygen saturation, VWF:Ag and ADAMTS-13 activity were all increased significantly in both groups, in postoperative 48 hours and postoperative 30 days in comparison with baseline moment. Normalized density of VWF main subunit (225 kDa) and proteolytic fragment with 176 kDa tended to increase in postoperative 48 hours and postoperative 30 days in both groups. The rate between ADAMTS-13 activity and VWF:Ag was lower than 1 in postoperative 48 hours, an indicating of enzyme consumption; however, in the postoperative 30 days the rate was 1:1 and VWF:Ag values were near those of reference. 29% of patients presented ADAMTS-13 inhibitors at the baseline moment. A study of correlation among variables as peripheral oxygen saturation, VWF:Ag, VWF subunit composition and ADAMTS-13 was done. It was observed that ADAMTS-13 correlated slightly positively with VWF:Ag and with VWF fragments 176 and 140 kDa, mainly in group B; in group A, the correlation at postoperative 48 hours tended to be negative. Most of the patients improved their peripheral oxygen saturation. The increased value of variables observed in postoperative 48 hours can be explained by the endothelial injury and inflammation caused by the surgery itself. This indicates an equilibrium between VWF:Ag and ADAMTS-13 in physiological conditions. However, this equilibrium could disappear when VWF is increased, probably by enzyme consumption. We conclude that ADAMTS-13 can act as a protective mechanism in these patients with thrombotic tendency

Neste trabalho é descrito um método prático e eficiente para dissociar, em subunidades &alpha; e &beta;, quantidades pequenas (da ordem de microgramas) dos hormônios foliculotrofina (hFSH), luteotrofina (hLH) e tireotrofina (hTSH) humana, nativos e recombinantes. A dissociação destes hormônios foi conseguida incubando-os, durante 16 horas, a 37ºC, com diferentes concentrações de ácido acético: 3M, 5M e 0,4M respectivamente para o hFSH, hLH e hTSH. Nestas condições, uma eficiência de dissociação acima de 98% foi obtida. Esta eficiência foi calculada com base nas determinações de massa dos heterodímeros e das subunidades, realizadas por MALDI-TOF-MS. Uma separação rápida e quantitativa das subunidades, com rendimentos da ordem de 80-90%, foi conseguida por cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa (RP-HPLC) em uma coluna C4. As subunidades foram caracterizadas quanto à pureza, hidrofobicidade, massa molecular e distribuição de carga por HPLC de exclusão molecular e fase reversa, SDS-PAGE e focalização isoelétrica. Quando analisadas quanto à hidrofobicidade, as subunidades mostraram-se aproximadamente iguais, enquanto as subunidades &beta; dos três heterodímeros apresentaram a seguinte escala de hidrofobicidade: &beta;-hFSH < &beta;-hTSH < &beta;-hLH. Com relação à massa molecular relativa (Mr), as subunidades &alpha; e &beta; do hFSH apresentaram as maiores Mr enquanto as subunidades do hLH as menores. A distribuição dos isômeros de carga das subunidades dos três hormônios ocorreu em uma região ácida, para o hFSH, em uma região básica, para o hLH e em uma região intermediária, para o hTSH. As subunidades &alpha; dos três hormônios, quando analisadas via SDS-PAGE, apresentaram praticamente a mesma mobilidade eletroforética, enquanto as subunidades &beta; apresentaram diferentes taxas de migração (mR), sendo mR &beta;-hFSH < mR &beta;-hTSH < mR &beta;-hLH. Diferenças relativas à massa molecular, hidrofobicidade, migração eletroforética e distribuição de carga foram encontradas entre as preparações recombinantes e hipofisárias dos três hormônios. O método descrito é suave, prático e flexível e pode ser adaptado à dissociação de outras glicoproteínas heterodiméricas recombinantes ou nativas. Permite não só estudos e caracterização direta de cada subunidade, como também detectar a presença de subunidades livres em preparações farmacêuticas, que são contaminantes indesejáveis, sendo, portanto, uma ferramenta extremamente útil para o controle de qualidade de produtos farmacêuticos. / In this work a practical and efficient method for the dissociation into &alpha;-and &beta;-subunits of small amounts (microgram range) of pituitaryderived and recombinant human follicle-stimulating hormone (hFSH), human luteotropin (hLH) and human thyrotropin (hTSH) is described. Dissociation was achieved by overnight treatment of the glycoproteins, at 37ºC, with acetic acid in different concentrations: 3M, 5M and 0,4M for hFSH, hLH and hTSH respectively. In these conditions, a dissociation efficiency of > 98% was attained. This efficiency was calculated on the basis of relative mass determinations of the heterodimers and subunits carried out via mass spectrometry (MALDI-TOF-MS). The &alpha;-and &beta;-subunits were rapidly and quantitatively separated by reversed-phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) on a C4 column with yields of the order of 80-90%. The isolated subunits were characterized concerning their purity, hidrophobicity, molecular mass and charge distribution, via size exclusion and RP-HPLC, SDS-PAGE and isoelectric focusing. When analyzed with relation to the hydrophobicity, the &alpha;-subunits presented approximately the same hydrophobicity, while &beta;-subunits showed the following scale: &beta-hFSH < &beta;-hTSH < &beta;-hLH. Concerning molecular mass, &alpha;- and &beta;-subunits of hFSH were shown to have the highest while hLH subunits the lowest. Charge isomers of the subunits of the three glycohormones were predominantly distributed in an acidic region for hFSH, in a basic region for hLH, and in a wider pH range (acidic and basic) for hTSH. Similar migration rates (mR), analyzed via SDS-PAGE, were observed for the &alpha;-subunits of the three hormones. A greater variation was found for the &beta;-subunits: mR &beta;-hFSH < mR &beta;-hTSH < mR &beta;-hLH. Differences between recombinant and pituitary preparations of three hormones were observed with relation to molecular mass, hydrophobicity, electrophoretic migration and charge distribution. The described method is mild, practical and flexible and can be adapted to dissociate any recombinant or native heterodimeric glycoprotein, allowing studies and direct characterization of each subunit as well as the detection of free subunits that are undesired contaminants in pharmaceutical preparations, being also an extremely useful tool for the quality control of pharmaceutical products.

O Streptococcus pyogenes (Grupo A de Lancefield) é uma bactéria Gram positiva e beta-hemolítica, responsável por infecções, tais como Faringite, Sepse, Fasciíte Necrotizante e Síndrome do Choque Tóxico Estreptocócico. Indivíduos suscetíveis podem desenvolver sequela não supurativa auto-imune pós-estreptocócica, como a Febre Reumática, Doença Reumática Cardíaca e a Glomerulonefrite Aguda. A proteína M é o principal antígeno bacteriano. Consiste em aproximadamente 450 resíduos de aminoácidos dispostos em quatro regiões (A, B, C e D), contendo alguns blocos de repetições. As regiões C e D são conservadas e a N-terminal (regiões A e B) é polimórfica. Atualmente, existem mais de 250 genótipos de emm conhecidos em todo o mundo, de acordo com o Centers for Disease Control and Prevention. Há vários anos, o desenvolvimento de uma vacina contra S. pyogenes (StreptInCor - identificação médica) foi iniciado, com base na região conservada da proteína M, com o objetivo de proteger o indivíduo vacinado contra infecções estreptocócicas, sem causar reações autoimunes. No presente estudo foi analisada a capacidade \"in vitro\" de anticorpos anti-StreptInCor neutralizarem/opsonizarem as cepas de S. pyogenes mais freqüentes em São Paulo, através da análise do reconhecimento das cepas por soros de camundongos imunizados com StreptInCor. Também foi avaliada por Western blotting a presença de anticorpos de reação cruzada dirigidos ao tecido cardíaco valvular humano. Anticorpos anti-StreptInCor foram capazes de neutralizar/opsonizar, pelo menos, cinco diferentes cepas mostrando que a imunização com StreptInCor pode ser eficaz contra várias cepas de S. pyogenes, assim como prevenir a infecção e sequelas subsequentes, sem causar reações auto-imunes. / Streptococcus pyogenes (Group A) is a Gram positive and beta-hemolytic bacteria, responsible for infections such as Pharyngitis, Sepsis, Necrotizing Fasciitis and Streptococcal Toxic Shock Syndrome. Susceptible individuals may develop post-streptococcal non-suppurative autoimmune sequelae such as Rheumatic Fever, Rheumatic Heart Disease and Acute Glomerulonephritis. The M protein is the major bacterial antigen. It consists of approximately 450 amino acid residues arranged in four regions (A, B, C and D), containing some repeated blocks. C and D regions are conserved and the N-terminus (regions A and B) is polymorphic. Currently there are over 250 known emm genotypes worldwide, according to the Centers for Disease Control and Prevention. Several years ago the development of a vaccine against S. pyogenes (StreptInCor - medical identification) was initiated, based on the M protein conserved region, aiming to protect against streptococcal infections without causing autoimmune reactions. In the present study we analyzed the \"in vitro\" ability of anti-StreptInCor antibodies to neutralize/opsonize the most frequent S. pyogenes strains in Sao Paulo by examining the strains recognition by sera from StreptInCor immunized mice. We also evaluated the presence of cross reactive antibodies directed to the human heart valve tissue by Western blotting. Anti-StreptInCor antibodies were able to neutralize/opsonize at least 5 strains, showing that the immunization with StreptInCor can be effective against several S. pyogenes strains as well as preventing infection and subsequent sequelae, without causing autoimmune reactions.

Neste trabalho é descrito um método prático e eficiente para dissociar, em subunidades &alpha; e &beta;, quantidades pequenas (da ordem de microgramas) dos hormônios foliculotrofina (hFSH), luteotrofina (hLH) e tireotrofina (hTSH) humana, nativos e recombinantes. A dissociação destes hormônios foi conseguida incubando-os, durante 16 horas, a 37ºC, com diferentes concentrações de ácido acético: 3M, 5M e 0,4M respectivamente para o hFSH, hLH e hTSH. Nestas condições, uma eficiência de dissociação acima de 98% foi obtida. Esta eficiência foi calculada com base nas determinações de massa dos heterodímeros e das subunidades, realizadas por MALDI-TOF-MS. Uma separação rápida e quantitativa das subunidades, com rendimentos da ordem de 80-90%, foi conseguida por cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa (RP-HPLC) em uma coluna C4. As subunidades foram caracterizadas quanto à pureza, hidrofobicidade, massa molecular e distribuição de carga por HPLC de exclusão molecular e fase reversa, SDS-PAGE e focalização isoelétrica. Quando analisadas quanto à hidrofobicidade, as subunidades mostraram-se aproximadamente iguais, enquanto as subunidades &beta; dos três heterodímeros apresentaram a seguinte escala de hidrofobicidade: &beta;-hFSH < &beta;-hTSH < &beta;-hLH. Com relação à massa molecular relativa (Mr), as subunidades &alpha; e &beta; do hFSH apresentaram as maiores Mr enquanto as subunidades do hLH as menores. A distribuição dos isômeros de carga das subunidades dos três hormônios ocorreu em uma região ácida, para o hFSH, em uma região básica, para o hLH e em uma região intermediária, para o hTSH. As subunidades &alpha; dos três hormônios, quando analisadas via SDS-PAGE, apresentaram praticamente a mesma mobilidade eletroforética, enquanto as subunidades &beta; apresentaram diferentes taxas de migração (mR), sendo mR &beta;-hFSH < mR &beta;-hTSH < mR &beta;-hLH. Diferenças relativas à massa molecular, hidrofobicidade, migração eletroforética e distribuição de carga foram encontradas entre as preparações recombinantes e hipofisárias dos três hormônios. O método descrito é suave, prático e flexível e pode ser adaptado à dissociação de outras glicoproteínas heterodiméricas recombinantes ou nativas. Permite não só estudos e caracterização direta de cada subunidade, como também detectar a presença de subunidades livres em preparações farmacêuticas, que são contaminantes indesejáveis, sendo, portanto, uma ferramenta extremamente útil para o controle de qualidade de produtos farmacêuticos. / In this work a practical and efficient method for the dissociation into &alpha;-and &beta;-subunits of small amounts (microgram range) of pituitaryderived and recombinant human follicle-stimulating hormone (hFSH), human luteotropin (hLH) and human thyrotropin (hTSH) is described. Dissociation was achieved by overnight treatment of the glycoproteins, at 37ºC, with acetic acid in different concentrations: 3M, 5M and 0,4M for hFSH, hLH and hTSH respectively. In these conditions, a dissociation efficiency of > 98% was attained. This efficiency was calculated on the basis of relative mass determinations of the heterodimers and subunits carried out via mass spectrometry (MALDI-TOF-MS). The &alpha;-and &beta;-subunits were rapidly and quantitatively separated by reversed-phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) on a C4 column with yields of the order of 80-90%. The isolated subunits were characterized concerning their purity, hidrophobicity, molecular mass and charge distribution, via size exclusion and RP-HPLC, SDS-PAGE and isoelectric focusing. When analyzed with relation to the hydrophobicity, the &alpha;-subunits presented approximately the same hydrophobicity, while &beta;-subunits showed the following scale: &beta-hFSH < &beta;-hTSH < &beta;-hLH. Concerning molecular mass, &alpha;- and &beta;-subunits of hFSH were shown to have the highest while hLH subunits the lowest. Charge isomers of the subunits of the three glycohormones were predominantly distributed in an acidic region for hFSH, in a basic region for hLH, and in a wider pH range (acidic and basic) for hTSH. Similar migration rates (mR), analyzed via SDS-PAGE, were observed for the &alpha;-subunits of the three hormones. A greater variation was found for the &beta;-subunits: mR &beta;-hFSH < mR &beta;-hTSH < mR &beta;-hLH. Differences between recombinant and pituitary preparations of three hormones were observed with relation to molecular mass, hydrophobicity, electrophoretic migration and charge distribution. The described method is mild, practical and flexible and can be adapted to dissociate any recombinant or native heterodimeric glycoprotein, allowing studies and direct characterization of each subunit as well as the detection of free subunits that are undesired contaminants in pharmaceutical preparations, being also an extremely useful tool for the quality control of pharmaceutical products.

O Streptococcus pyogenes (Grupo A de Lancefield) é uma bactéria Gram positiva e beta-hemolítica, responsável por infecções, tais como Faringite, Sepse, Fasciíte Necrotizante e Síndrome do Choque Tóxico Estreptocócico. Indivíduos suscetíveis podem desenvolver sequela não supurativa auto-imune pós-estreptocócica, como a Febre Reumática, Doença Reumática Cardíaca e a Glomerulonefrite Aguda. A proteína M é o principal antígeno bacteriano. Consiste em aproximadamente 450 resíduos de aminoácidos dispostos em quatro regiões (A, B, C e D), contendo alguns blocos de repetições. As regiões C e D são conservadas e a N-terminal (regiões A e B) é polimórfica. Atualmente, existem mais de 250 genótipos de emm conhecidos em todo o mundo, de acordo com o Centers for Disease Control and Prevention. Há vários anos, o desenvolvimento de uma vacina contra S. pyogenes (StreptInCor - identificação médica) foi iniciado, com base na região conservada da proteína M, com o objetivo de proteger o indivíduo vacinado contra infecções estreptocócicas, sem causar reações autoimunes. No presente estudo foi analisada a capacidade \"in vitro\" de anticorpos anti-StreptInCor neutralizarem/opsonizarem as cepas de S. pyogenes mais freqüentes em São Paulo, através da análise do reconhecimento das cepas por soros de camundongos imunizados com StreptInCor. Também foi avaliada por Western blotting a presença de anticorpos de reação cruzada dirigidos ao tecido cardíaco valvular humano. Anticorpos anti-StreptInCor foram capazes de neutralizar/opsonizar, pelo menos, cinco diferentes cepas mostrando que a imunização com StreptInCor pode ser eficaz contra várias cepas de S. pyogenes, assim como prevenir a infecção e sequelas subsequentes, sem causar reações auto-imunes. / Streptococcus pyogenes (Group A) is a Gram positive and beta-hemolytic bacteria, responsible for infections such as Pharyngitis, Sepsis, Necrotizing Fasciitis and Streptococcal Toxic Shock Syndrome. Susceptible individuals may develop post-streptococcal non-suppurative autoimmune sequelae such as Rheumatic Fever, Rheumatic Heart Disease and Acute Glomerulonephritis. The M protein is the major bacterial antigen. It consists of approximately 450 amino acid residues arranged in four regions (A, B, C and D), containing some repeated blocks. C and D regions are conserved and the N-terminus (regions A and B) is polymorphic. Currently there are over 250 known emm genotypes worldwide, according to the Centers for Disease Control and Prevention. Several years ago the development of a vaccine against S. pyogenes (StreptInCor - medical identification) was initiated, based on the M protein conserved region, aiming to protect against streptococcal infections without causing autoimmune reactions. In the present study we analyzed the \"in vitro\" ability of anti-StreptInCor antibodies to neutralize/opsonize the most frequent S. pyogenes strains in Sao Paulo by examining the strains recognition by sera from StreptInCor immunized mice. We also evaluated the presence of cross reactive antibodies directed to the human heart valve tissue by Western blotting. Anti-StreptInCor antibodies were able to neutralize/opsonize at least 5 strains, showing that the immunization with StreptInCor can be effective against several S. pyogenes strains as well as preventing infection and subsequent sequelae, without causing autoimmune reactions.

A síndrome de McCune Albrigth (SMA) é uma doença genética não hereditária, com incidência estimada entre 1/100.000 e 1/1.000.000 casos/ano. A SMA caracteriza-se clinicamente pela tríade: displasia óssea fibrosa (FD), manchas cutâneas café-com-leite e hiperfunção endócrina tais como: síndrome de Cushing, pseudo-puberdade precoce, hipertiroidismo, acromegalia. O diagnóstico da SMA clássica é usualmente baseado no quadro clínico associado a dosagens hormonais e exames de imagem, principalmente cintilografia do esqueleto. No entanto, quadros atípicos e formas parciais muitas vezes dificultam o diagnóstico preciso da síndrome. O objetivo deste estudo foi padronizar dentre as técnicas de PNA (peptide nucleic acid) e PCT em Tempo Real, para a detecção de polimorfismos de base única (SNPs), a técnica mais sensível para a discriminação das mutações ativadoras da subunidade da proteína G. Para este estudo foram selecionados 32 pacientes, 1 masculino e 31 femininos, com SMA, todos em seguimento no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da USP. Como resultado positivo, apresentamos nesse trabalho pela primeira vez o uso do RT-PCR genotipagem na detecção das mutações ativadoras da proteína G, em DNA extraído de tecidos afetados e em leucócitos de sangue periférico, sendo a técnica considerada sensível o suficiente para discriminar de forma simples e rápida as mutações ativadoras da PGs. Sugerimos nesse estudo o uso da técnica de discriminação alélica pelo sistema Taqman. Essa técnica possibilita a detecção destas mutações gsp no sangue periférico mesmo numa baixa porcentagem, uma vez que nem sempre o tecido afetado (gônada, osso, hipófise) é disponível. / The McCune-Albright Syndrome (MAS) is a genetic disease, with incidence estimated at 1/100.000 and 1/1000000 cases per year. MAS is clinically characterized by the triad: bone fibrous dysplasia (FD) café-au-lait skin spots and endocrine hyperfunction, such as: precocious puberty (PP), Cushing's syndrome, hyperthyroidism and acromegaly. The diagnosis of MAS is originally based on clinical characteristics associated with hormonal and imaging studies. However, atypical and partial forms often hamper the accurate diagnosis of the syndrome. For this study we selected 32 patients, 1male and 31 females, all being treated in Hospital das Clínicas, School of Medicine, University of São Paulo. As a positive result, we showed for the first time the use of Real Time PCR/genotyping for the detection of activating mutations of the stimulatory G protein, using blood leucocytes DNA. This technique was sensible and can bring fast results for the patient and the physician, making the diagnosis easier. Our study proposes the use of allelic discrimination by Taqman system, which can be used as a probe that allows the identification of specific genotypes. These techniques could help detect these mutations in peripheral blood when the affected tissue is not available.

A hipóxia é capaz de alterar muitos mecanismos bioquímicos nas células endoteliais. Dentre eles, a indução da expressão endotelial de moléculas de adesão, como o fator de von Willebrand (FVW) que, em resposta ao estímulo, é secretado em sua forma mais ativa na interação com as plaquetas, o que pode resultar em trombose. Nas condições fisiológicas, o padrão multimérico do FVW no plasma é essencialmente determinado pela ADAMTS-13 (uma desintegrina e metaloproteinase com domínios trombospondina). Este estudo teve como objetivo verificar se a atividade da enzima ADAMTS-13, assim como as características do FVW relacionáveis a ela, poderiam estar alteradas na presença de hipoxemia comparativamente à condição de oxigenação normal. Este estudo longitudinal envolveu 56 pacientes portadores de cardiopatias congênitas cianogênicas, em idades entre um e sete anos, candidatos ao tratamento cirúrgico. Os pacientes foram avaliados no pré-cirúrgico (basal), no pós-operatório imediato (pós 48 horas) e após 30 dias de cirurgia, e foram divididos em dois grupos (A e B) baseado na saturação periférica de oxigênio (SpO2) no momento pós 30 dias. Foram determinados o antígeno do FVW e a análise das suas subunidades, a atividade da ADAMTS-13 e a presença de inibidores da ADAMTS-13. Os pacientes de ambos os grupos apresentaram aumento significante da SpO2, da concentração antigênica do FVW e da atividade da ADAMTS-13 nos momentos pós 48 horas e pós 30 dias em comparação com o momento pré (basal). As densidades normalizadas da subunidade principal do FVW (225 kDa) e do fragmento de 176 kDa apresentaram tendência ao aumento nos momentos pós 48 horas e pós 30 dias nos dois grupos. A razão entre a atividade da ADAMTS-13 e o FVW estava menor do que 1 no momento pós 48 horas, indicando consumo da enzima; entretanto, no momento pós 30 dias a razão fica 1:1, e o FVW se aproxima dos valores de referência. Verificamos ainda que 29% destes pacientes apresentaram inibidores contra a ADAMTS-13 no momento pré-operatório. Ainda explorando as variáveis SpO2, FVW:Ag, atividade da ADAMTS-13 e a composição das subunidades do FVW, foi feito um estudo de correlação linear entre estas variáveis. Observamos uma baixa correlação entre a enzima ADAMTS-13 e o FVW:Ag, e da enzima com os fragmentos do FVW de 176 e 140 kDa, principalmente no grupo B. No grupo A, esta correlação no momento pós 48 horas mostrou tendência a ser negativa. A maioria dos pacientes apresentou melhoras na saturação periférica de oxigênio. O aumento das variáveis estudadas no pós-operatório imediato pode ter ocorrido em função da cirurgia, que provavelmente ocasionou um quadro de lesão endotelial com inflamação, indicando que pode existir um equilíbrio entre o FVW e a ADAMTS-13 em níveis fisiológicos. Entretanto, este equilíbrio pode ser quebrado quando ocorre aumento do FVW, provavelmente por consumo da enzima. Parece-nos, portanto, que a ADAMTS-13 pode funcionar como um mecanismo de proteção a estes pacientes com tendência à trombose / Hypoxia has been shown to alter several biochemical mechanisms in endothelial cells. In addition, hypoxia induces the endothelial expression of adhesion molecules, including von Willebrand factor (VWF). Increased release of high-molecular-weight VWF multimers is associated with higher risk for thrombotic events. In physiological conditions, the multimeric pattern of plasma VWF is essentially determined by the action of ADAMTS-13 (a desintegrin and metalloprotease with thrombospondin type 1 domains). The aim of this study was to investigate if ADAMTS-13 activity and VWF subunit fragments were altered by hypoxia in cyanotic congenital heart disease. Fiftysix patients (age 1 to 7 years) with cyanotic congenital heart disease admitted to the Heart Institute for heart surgery were included in this longitudinal study. Patients were evaluated before (baseline) corrective surgery, postoperative 48 hours and postoperative 30 days. Patients were classified in two groups (A and B) based on the peripheral oxygen saturation after 30 days surgery. VWF antigenic concentration, VWF subunit composition, ADAMTS-13 activity and presence of ADAMTS-13 inhibitors were determined. Peripheral oxygen saturation, VWF:Ag and ADAMTS-13 activity were all increased significantly in both groups, in postoperative 48 hours and postoperative 30 days in comparison with baseline moment. Normalized density of VWF main subunit (225 kDa) and proteolytic fragment with 176 kDa tended to increase in postoperative 48 hours and postoperative 30 days in both groups. The rate between ADAMTS-13 activity and VWF:Ag was lower than 1 in postoperative 48 hours, an indicating of enzyme consumption; however, in the postoperative 30 days the rate was 1:1 and VWF:Ag values were near those of reference. 29% of patients presented ADAMTS-13 inhibitors at the baseline moment. A study of correlation among variables as peripheral oxygen saturation, VWF:Ag, VWF subunit composition and ADAMTS-13 was done. It was observed that ADAMTS-13 correlated slightly positively with VWF:Ag and with VWF fragments 176 and 140 kDa, mainly in group B; in group A, the correlation at postoperative 48 hours tended to be negative. Most of the patients improved their peripheral oxygen saturation. The increased value of variables observed in postoperative 48 hours can be explained by the endothelial injury and inflammation caused by the surgery itself. This indicates an equilibrium between VWF:Ag and ADAMTS-13 in physiological conditions. However, this equilibrium could disappear when VWF is increased, probably by enzyme consumption. We conclude that ADAMTS-13 can act as a protective mechanism in these patients with thrombotic tendency

Orientador: Ricardo Della Coletta / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-22T21:07:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bufalino_Andreia_D.pdf: 2552060 bytes, checksum: 9156e1c08764322bea090809a2b166d5 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Ativina A é um membro da família dos fatores de crescimento transformante-? e sua expressão têm sido associados ao desenvolvimento tumoral. Contudo, sua expressão, função e mecanismos de regulação, por exemplo, via folistatina, no carcinoma espinocelular (CEC) oral é parcialmente conhecida. Diante disto, nosso estudo teve como objetivo avaliar a participação de ativina A na tumorigênese dos CECs orais. Para alcançar este objetivo, a expressão imuno-histoquímica de ativina A foi analisada em 115 amostras de CEC oral e sua expressão foi correlacionada com características clínico-patológicas e de sobrevida. In vitro a influência de ativina A sobre os principais eventos biológicos relacionados à tumorigênese oral foi verificada por 3 abordagens: 1) exposição da linhagem celular HaCAT a ativina A recombinante nas concentrações de 0, 1, 10 e 100 ng/ml, 2) tratamento das linhagens tumorais LN2 com folistatina recombinante nas concentrações de 0, 1, 10 e 100 ng/ml e 3) silenciamento estável da expressão de ativina A na linhagem LN2 com RNA de interferência (shINHBA). A expressão aumentada de ativina A em CECs orais foi significantemente correlacionada com a presença de metástases regionais (estádio N, p=0,034), tumores classificados como pobremente diferenciados (p=0,013) e demonstrou ser preditiva de um menor período de sobrevida livre de doença em 5 anos (HR: 1,74; 95% CI: 1,39-2,97; p=0,016). Os resultados dos estudos in vitro revelaram que ativina A apresenta um efeito pleotrópico no controle dos principais eventos associados à tumorigênese oral. A exposição das células HaCAT a ativina A resultou em um significante bloqueio da morte celular por apoptose e necrose, promoveu alteração do padrão de expressão dos marcadores da transição epitélio mesenquimal (TEM), aumentou a adesão celular aos componentes da matriz extracelular (MEC) e induziu a invasão e migração celular. Por outro lado, o tratamento das células LN2 com folistatina foi capaz de induzir significantemente a apoptose e a morte celular por necrose, reduzir a proliferação celular, alterar o padrão de expressão dos marcadores da TEM, além de reduzir a adesão celular aos componentes da MEC e os potenciais invasivo e migratório. O bloqueio de ativina A com a transdução estável de shINHBA na linhagem tumoral LN2 promoveu significantemente a apoptose e a morte por necrose, alterou a expressão dos marcadores da TEM de maneira similar aos efeitos da folistatina e reduziu a proliferação, invasão, migração e motilidade celular, que foi avaliada por formação de filopódios e lamelipódios. Interessantemente, o bloqueio com shINHBA significantemente facilitou a adesão das células LN2 aos componentes da MEC, diferente do que foi observado no tratamento com folistatina. Em conclusão, os resultados deste estudo sugerem que a ativina A regula eventos biológicos essenciais para a tumorigênese oral e é um fator prognóstico independente de sobrevida livre de doença em pacientes com CECs orais / Abstract: Activin A is a member of the transforming growth factor-? family and its deregulated expression has been described in different cancers. However, its expression, function and regulatory mechanisms, particularly via follistatin, in oral squamous cell carcinoma (OSCC) are partially known. The aim of the present study was to evaluate the role of activin A in the promotion of oral tumorigenesis. To achieve this goal, immunohistochemical expression of activin A was analyzed in 115 samples of OSCCs and its expression was correlated with clinicopathological features and outcome. In vitro, the influence of activin A on oral tumorigenesis was determined by 3 different approaches: 1) exposition of HaCaT cells to recombinant activin A in different concentrations (0, 1, 10 and 100 ng/ml), 2) treatment of LN2 tumor cells with recombinant follistatin in different concentrations (0, 1, 10 and 100 ng/ml) and 3) stable knockdown of activin A expression in the LN2 tumor cells by using interferencing RNA (shINHBA). Increased activin an expression in OSCCs was significantly correlated with the presence of regional metastases (stage N, p=0.034), poorly differentiated tumors (p=0.013), and shown to be predictive of a shortened disease-free survival (HR: 1.74, 95% CI: 1.39-2.97, p=0.016). In vitro studies showed a pleotropic effect of activin an on control of key events associated with oral tumorigenesis. Activin A resulted in a reduction of cell death by apoptosis and necrosis, promoted changes in the expression of epithelial-mesenchymal transition (EMT) markers, increased cell adhesion to extracellular matrix (ECM) components and induced cell invasion and migration in HaCAT cells. On the other hand, the inhibition of activin a using follistatin induced apoptosis and cell death by necrosis, reduced cell proliferation, changed the expression of EMT markers, reduced cell adhesion to ECM components and reduced the cell invasion and migration in LN2 cells. The activin a knockdown with shINHBA stable transduction in the tumor cell line LN2 significantly promoted death by apoptosis and necrosis changed the expression of EMT markers, and decreased cell proliferation, invasion, migration and motility evaluated by lamellipodia and filopodia formation. Interestingly, knockdown with shINHBA significantly promoted the adhesion of cells to ECM components in LN2 cells, different to the results observed in the treatment with follistatin. In conclusion, our results suggest that activin A regulate biological events essential for oral tumorigenesis, and is an independent prognostic factor for disease-free survival in patients with OSCCs / Doutorado / Patologia / Doutora em Estomatopatologia

Made available in DSpace on 2016-05-19T13:08:18Z (GMT). No. of bitstreams: 2 199.pdf: 2457764 bytes, checksum: f3219878be3144c523ae28e85c474b10 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil / Os tripanossomatídeos são caracterizados por processos moleculares diferenciados como a transcrição policistrônica e regulação pós-transcricional da expressão gênica. Em mamíferos, a tradução se inicia com a ligação do complexo eIF4F (formado pelos eIF4A, eIF4E e eIF4G) a extremidade 5' dos mRNAs, o que facilita seu reconhecimento pelo ribossomo. A atividade do eIF4F é reforçada pela proteína de ligação a cauda poli-A (PABP), na extremidade 3' dos mRNAs, que interage com o eIF4G. Dois complexos do tipo eIF4F foram identificados em tripanossomatídeos: o primeiro formado pelos EIF4G3, EIF4E4 e EIF4AI com a PABP1; e um outro baseado na interação do EIF4G4 com o EIF4E3 e o EIF4A1. Este trabalho buscou caracterizar as interações entre as subunidades destes complexos e sua associação com PABPs de Leishmania, avaliando o efeito de mutações em motivos específicos. Proteínas recombinantes foram geradas fusionadas a GST e avaliadas quanto a sua habilidade de interagir com parceiros marcados radioativamente em ensaios do tipo pull-down. Para o EIF4G3, mutações individuais em dois resíduos vizinhos (I8A e R9A), afetaram a interação com o EIF4E4 e a mutação de ambos os resíduos equivalentes do EIF4G4 (IL25-26AA) também impediu sua ligação ao EIF4E3, sugerindo um motivo comum para a ligação aos seus parceiros. As proteínas EIF4E3 e EIF4E4 foram avaliadas quanto à capacidade de interagir com a PABP2 e PABP1 respectivamente, e mutações em motivos conservados nas regiões N-terminais dos EIF4E (Boxes A, B e C) aboliram sua interação com os homólogos da PABP. Para identificar que regiões da PABP1 estão relacionadas às interações com o parceiro EIF4E4, foram obtidas proteínas PABP1 mutantes em motivos conservados e observou-se que a mutação no motivo TGM, C-terminal, aboliu sua interação com o EIF4E4. Com estas abordagens conseguiu-se avançar na definição das interações entre as referidas subunidades do eIF4F e PABP, identificando-se diferenças relevantes em relação a outros eucariotos