Bei der Duchenne Muskeldystrophie (DMD) handelt es sich um eine erblich bedingte, progredient verlaufende Muskelschwäche mit frühzeitigem tödlichem Ausgang. Durch eine Mutation des Dystrophingens kommt es aufgrund fehlender mechanischer Stabilität der Muskelzellen zur Muskelschwäche und dem Ersatz von Muskelgewebe durch Binde- und Fettgewebe. Ein weiteres Kennzeichen der Erkrankung ist ein pathologisch erhöhter Kalziumgehalt der Muskelzellen, der zu gestörten Signalwegen und dem Zelltod führt. Die DMD kommt auch bei Mäusen vor, wobei das Mdx-Mausmodell das bekannteste und am besten erforschte Modell der Erkrankung ist. Die Mäuse besitzen im Gegensatz zum Menschen allerdings ein De- und Regenerationspotenzial der Muskulatur, was die Übertragbarkeit der Ergebnisse auf die menschliche DMD erschwert, da sich die Pathophysiologie der Mäuse abgemildert darstellt. Daher ist es notwendig, das Modell hinsichtlich der Degeneration der Muskulatur zu verbessern, was durch eine unilaterale Injektion von Botox in den rechten M.masseter, die zu dessen Lähmung führt, gewährleistet werden sollte. Das vom Bakterium Clostridium botulinum produzierte Endotoxin Botulinumtoxin A (Botox) wird in der Zahnmedizin unter anderem eingesetzt, um die Masseterhypertrophie zu behandeln. Botox hemmt die Freisetzung von Acetylcholin an der neuromuskulären Endplatte, was zur Hemmung der Muskelkontraktion führt, welche beendet wird, wenn durch das Sprossen neuer Axone eine Reinnervation der Muskulatur stattfindet. Unter dem Einfluss von Botox zu unterschiedlichen Untersuchungszeitpunkten sollte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass sich die Expression der kalziumregulierenden Gene der Mdx-Mäuse dahingehend verändern, dass ein verschlechterter Phänotyp bei den dystrophen Mäusen resultiert. Das Mdx-Mausmodell sollte der menschlichen DMD angepasst werden, indem das regenerative Potenzial der dystrophen Mäuse durch die Botox-Injektion und dem damit verbundenen unilateralen Funktionsverlust der Muskulatur unterbrochen wird. Weiterhin stellte sich die Frage, ob durch die Botox-Injektion auch bei den gesunden Mäusen ein Duchenne-ähnlicher Phänotyp auf der behandelten Seite erzeugt werden kann. Dazu wurden in dieser Arbeit die Kaumuskeln M.masseter, M.temporalis und die Zunge von 100 Tage alten Kontroll- und Mdx-Mäusen hinsichtlich ihres Kalziumstoffwechsels 3 bzw. 6 Wochen nach der Botox-Injektion untersucht. Die Genexpression der untersuchten Gene wurde durch quantitative RT-PCR erhoben. Bei der Kontrollgruppe waren 3 Wochen nach der Botox-Injektion im rechten M.masseter alle untersuchten Gene mit Ausnahme von Atp2a1 und Pvalb erhöht. Die erhöhten Expressionen im Vergleich zur linken Seite lagen zwischen dem 1,7-und 15,3fachen. Sechs Wochen nach der Botox-Injektion waren alle Gene im rechten M.masseter mit Ausnahme von Atp2a2 und Sln zwischen dem 1,9- und 4,6fachen erhöht. Bei Sln kam es zu einer Reduktion um 88% verglichen mit der linken Seite. Im M.temporalis der Kontrolltiere konnten 3 Wochen nach der Injektion die Gene Slc8a1 und Sln um das 1,8- bzw. 13,2fache erhöht im Vergleich zur linken Seite nachgewiesen werden. Atp2a1 wurde im rechten M.temporalis um 47% weniger exprimiert als auf der linken Seite. Sechs Wochen nach der Injektion konnten im M.temporalis keine Veränderungen mehr festgestellt werden. Bei den Mdx-Mäusen wurde 3 Wochen nach der Botox-Injektion im rechten M.masseter bei den Genen Atp2a2, Pln und Sln erhöhte Genexpressionen um das Doppelte, 2,2- und 2,8fache im Vergleich zur linken Seite nachgewiesen. Im M.temporalis kam es 3 Wochen nach der Injektion auf der rechten Seite zu einer Erhöhung von Sln um das 8,5fache im Vergleich zur linken Seite. Sechs Wochen nach der Injektion gab es in beiden rechten Muskeln keine Veränderungen mehr. Bei den gesunden Mäusen konnte durch die Botox-Injektion zu keinem der beiden Untersuchungszeitpunkte und in keiner der Muskelproben ein Duchenne-ähnlicher Phänotyp erzeugt werden, auch wenn einzelne Gene eine Verschlechterung des Phänotyps anzeigen, gleichzeitig andere Genveränderungen jedoch auf einen positiven Einfluss auf den Phänotyp schließen lassen. Die Funktion des M.temporalis gleicht außerdem den Funktionsverlust des M.masseter ausreichend aus. Bei den Mdx-Mäusen konnte im rechten M.masseter ebenfalls keine eindeutige Verschlechterung des Phänotyps 3 Wochen nach der Botox-Injektion nachgewiesen werden. Die veränderten Genexpressionen lassen sowohl positiven als auch negativen Einfluss auf den Phänotyp zu, sodass es in der Gesamtbetrachtung nicht zu einer Verschlechterung des Phänotyps kommen muss. Zum späteren Untersuchungszeitpunkt konnten bei den Mdx-Mäusen keinerlei Veränderungen hinsichtlich der Genexpression in den beiden Muskelproben nachgewiesen werden. Es ist davon auszugehen, dass die Botox-Wirkung nachgelassen bzw. aufgehört hat und es bereits zu einer Reinnervation im M.masseter kam, die auch durch das Regenerationspotenzial der Mdx-Mäuse erklärt werden kann. Auch in anderen Untersuchungen konnte der vielversprechende Ansatz einer durch Botox induzierten Muskellähmung nicht zu einer Verschlechterung des Phänotyps der Kaumuskeln bei gesunden und Mdx-Mäusen führen.:Abkürzungsverzeichnis
Abbildungsverzeichnis
Tabellenverzeichnis
1. Einleitung
1.1. Muskeldystrophie Duchenne
1.2. Das Dystrophinprotein
1.3. Der Kalziumstoffwechsel
1.4. Tiermodelle
1.4.1. Maus
1.4.2. Hund
1.4.3. Schwein
1.4.4. Ratte
1.5. Botulinumtoxin in der Zahnmedizin
1.6. Ziele der Arbeit
2. Material und Methoden
2.1. Material
2.1.1. Geräte
2.1.2. Chemikalien
2.1.3. Kits
2.1.4. Sonden/Primer
2.1.5. Software
2.2. Methoden
2.2.1. Versuchstiere und Probengewinnung
2.2.2. Gelelektrophorese
2.2.3. RNA-Gewinnung
2.2.4. cDNA-Synthese
2.2.5. Quantitative real time PCR (qRT-PCR)
2.2.6. Quantifizierungsmethoden
2.2.6.1. ΔΔCT-Methode
2.2.7. Statistische Auswertung
3. Ergebnisse
3.1. Gelelektrophorese
3.2. mRNA-Gehalt 3 Wochen nach Botox-Injektion
3.2.1. Expression von Atp2a1
3.2.2. Expression von Atp2a2
3.2.3. Expression von Atp2b4
3.2.4. Expression von Cacna1s
3.2.5. Expression von Pvalb
3.2.6. Expression von Pln
3.2.7. Expression von Ryr1
3.2.8. Expression von Slc8a1
3.2.9. Expression von Sln
3.3. mRNA-Gehalt 6 Wochen nach Botox-Injektion
3.3.1. Expression von Atp2a1
3.3.2. Expression von Atp2a2
3.3.3. Expression von Atp2b4
3.3.4. Expression von Cacna1s
3.3.5. Expression von Pvalb
3.3.6. Expression von Pln
3.3.7. Expression von Ryr1
3.3.8. Expression von Slc8a1
3.3.9. Expression von Sln
3.4. Vergleich der mRNA-Gehalte 3 Wochen und 6 Wochen nach der Botox-Injektion
3.4.1. Atp2a1
3.4.2. Atp2a2
3.4.3. Atp2b4
3.4.4. Cacna1s
3.4.5. Pvalb
3.4.6. Pln
3.4.7. Ryr1
3.4.8. Slc8a1
3.4.9. Sln
4. Diskussion
4.1. Erzeugung eines Duchenne-ähnlichen Phänotyps bei gesunden Mäusen durch Botox-Injektion
4.2. Verschlechterung des Phänotyps bei Mdx-Mäusen
4.3. Unterschiede zwischen den Untersuchungszeitpunkten
4.4. Schlussfolgerungen und kritische Auseinandersetzung mit dem Versuchsaufbau
5. Zusammenfassung
6. Summary
7. Literatur
8. Danksagung
9. Anlage 1: Erklärung zur Eröffnung des Promotionsverfahrens
10. Anlage 2: Erklärung zur Einhaltung aktueller gesetzlicher Vorgaben
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa:de:qucosa:90351 |
| Date | 04 June 2024 |
| Creators | Stehle, Pia Karina |
| Contributors | Keil, Christiane, Lauer, Günter, Technische Universität Dresden |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | German |
| Detected Language | German |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, doc-type:doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, doc-type:Text |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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