Abstract
For decades, the mammalian kidney has served as a model system for studying developmental processes, such as induced epithelialization, branching morphogenesis, and cell differentiations. The possibility to recapitulate and follow the renal organogenesis ex vivo in organ culture set-ups has provided a large amount of molecular and cellular information about sequential events during development. However, certain limitations remain when combining traditional organ culture set-ups with modern molecular technology. This thesis seeks to address these disadvantages.
In the experimental part of the thesis, the traditional organ culture set-ups were studied, modified, and optimized to meet the needs of functional genetic screening. First, the traditional transfilter- induced nephrogenesis was characterized with a panel of nephron segment specific markers to reveal the differentiation level of in vitro developing mouse renal tissue. A comprehensive genome wide time course microarray analysis was also performed to in vitro- induced metanephric mesenchyme.
Next, to improve the accessibility of genetic tools into the three- dimensional organ in culture, the classic kidney culture set-ups were modified to tolerate dissociation and re-aggregation before the induction of nephrogenesis. This step was achieved with the aid of preservative growth factors offering a 24- hour window to manipulate the genetic and cellular composition of the explant. The dissociation and re-aggregation per se had not particular effect on the progress of the nephron differentiation. Demonstrations of the addition and removal of cells, as well as a virus vector mediated gene knock in and knock down are presented.
The gene expression data, together with the novel organ manipulation and culture techniques presented in this thesis, provide a useful guide and specific tools to further characterize the details of nephron development and differentiation in functional manner. / Tiivistelmä
Nisäkkäiden munuainen on toiminut vuosikymmeniä mallielimenä tutkittaessa kehitysbiologisia tapahtumasarjoja, kuten epitelisaatiota, haaroittumismorfologiaa sekä solujen erilaistumista. Munuaisaihioita voidaan viljellä laboratorio-olosuhteissa, jolloin kehityksen aikaisia muutoksia päästään seuraamaan lähes reaaliaikaisesti. Perinteisten kudosviljelytekniikoiden tarjoamat mahdollisuudet solujen molekulaariseen muokkaukseen ovat kuitenkin varsin rajalliset. Tässä väitöskirjassa esitettävät tulokset pyrkivät osaltaan vähentämään näitä rajoitteita.
Väitöskirjan kokeellisessa osassa tarkastellaan lähemmin klassista munuaiskudosviljelyä sekä esitetään siihen tehtyjä optimointeja, joiden avulla kudosviljelyä pyritään hyödyntämään geenien toiminnan tutkimuksessa. Aluksi perinteisellä tavalla reikäisen kalvon läpi indusoitu nefroni karakterisoitiin tarkasti hyödyntäen useita erilaistumista osoittavia merkkimolekyylejä. Lisäksi samalla tekniikalla tuotettujen munuaiskudosviljelmien geeniekspressiota tutkittiin mikrosiruanalyysillä.
Klassisia kudosviljelytekniikoita muokattiin soveltuvammaksi moderneille geneettisille työkaluille. Munuaiskudos hajotettiin ensin solususpensioksi, jonka jälkeen solut muodostivat uudelleen kolmiulotteisen, kudosmaisen rakenteen. Hyödyntämällä suojaavia kasvutekijöitä, hajotus kyettiin tekemään jo ennen nefronien muodostumisen alkua. Näin saavutettin 24 tunnin aikaikkuna indusoimattoman kudoksen geneettiselle muokkaukselle. Väitöskirjassa esitelläänkin demonsrtaatiot solujen lisäämisestä ja poistamisesta sekä virusvälitteisestä geenin aktivoinnista ja hiljennyksestä hyödyntäen uutta kudosmanipulaatio ja –vilejelytekniikkaa.
Nefronin kehityksen aikaisen geeniekspression kartoitus sekä tässä tutkimuksessa kehitetyt uudet kudosmanipulaatio ja -viljelytekniikat tarjoavat yhdessä työkaluja molekyylitason yksityiskohtaiseen tutkimiseen.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:oulo.fi/oai:oulu.fi:isbn978-952-62-0660-8 |
| Date | 05 December 2014 |
| Creators | Junttila, S. (Sanna) |
| Contributors | Vainio, S. (Seppo) |
| Publisher | Oulun yliopisto |
| Source Sets | University of Oulu |
| Language | English |
| Detected Language | Finnish |
| Type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/publishedVersion |
| Format | application/pdf |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess, © University of Oulu, 2014 |
| Relation | info:eu-repo/semantics/altIdentifier/pissn/0355-3221, info:eu-repo/semantics/altIdentifier/eissn/1796-2234 |
Page generated in 0.002 seconds