RésuméLes kinésines sont des moteurs moléculaires impliqués dans le transport intracellulaire de nombreux cargos au sein de la cellule. Bien que la motilité des kinésines soit bien comprise, les mécanismes moléculaires à la base du recrutement des cargos le sont beaucoup moins.La kinésine1 joue divers rôles dans les cellules neuronales, où elle contribue à l’organisation spatiale et temporelle de nombreux composants cellulaires. Elle jouerait un rôle dans différentes pathologies neurologiques, comme la maladie d’Alzheimer. Comprendre comment la kinésine1 reconnaît et interagit avec ses cargos est important pour déterminer son rôle, ainsi que celui de ses cargos, au niveau du fonctionnement des cellules normales et pathologiques. La kinésine1 est un hétérotétramère constitué de deux chaînes lourdes (KHC) et de deux chaînes légères (KLC) toutes deux étant capables de recruter des protéines cargos. L’une des premières protéines cargos à avoir été identifiée est JIP1 (JNK-interacting protein 1) qui est, entre autres: (i) une protéine d’échafaudage pour la voie de signalisation des MAP kinases et (ii) une protéine adaptatrice pour le transport de la protéine précurseur de l’amyloïde (APP) responsable de la maladie d’Alzheimer. Dans les deux cas, JIP1 régule des processus critiques au niveau de la cellule, ce qui en fait une protéine intéressante à étudier. Des premières études ont permis de mieux comprendre comment JIP1 est recrutée et transportée par la kinésine1. Cependant, le détail de l’interaction entre KLC et JIP1 n’est pas encore complètement décrit et donc compris.Objectifs : Mon travail de doctorat vise à caractériser au niveau moléculaire l’interaction entre KLC et JIP1. Pour ce faire, j’avais pour objectifs : 1) de caractériser les domaines d’interaction des deux protéines seules, 2) d’étudier la formation du complexe en solution par des approches biophysiques et 3) de déterminer la structure 3D du complexe par cristallographie.Résultats : Dans un premier temps, j’ai caractérisé le domaine TPR de KLC seul en contribuant entre autres au développement d’une boite à outils moléculaires. J’ai aussi participé à la détermination de deux structures cristallographiques du domaine TPR de KLC1/2 permettant de mettre en évidence la plasticité structurale de la 1ère hélice de ce domaine (Nguyen et al, soumis). Dans un second temps, j’ai mis en place les conditions d’expression et de purification du domaine PTB de JIP1 et mener la caractérisation structurale de ce domaine en solution. Bien que ce domaine de JIP1 ne soit pas nécessaire pour l’interaction avec KLC, j’ai pu étudier l’impact de sa présence au niveau du recrutement par KLC. Finalement, j’ai caractérisé le recrutement de JIP1 par KLC en confirmant tout d’abord un certain nombre d’information sur l’interaction entre le domaine TPR de KLC et la région C-terminale (Cter) de JIP1 au niveau moléculaire. Les nombreux essais de cristallisation que j’ai menés n’ont pas permis d’obtenir des cristaux du complexe KLC:JIP1. J’ai cependant pu cartographier de façon précise la zone d’interaction de JIP1-Cter avec le domaine TPR de KLC en employant les différents outils de KLC disponibles pour déterminer par calorimétrie leur affinité avec JIP1-Cter (Nguyen et al., en préparation).Conclusion : Ainsi, mon travail de doctorat a permis de mieux comprendre 1) la versatilité structurale du domaine TPR de KLC, 2) l’impact du domaine PTB de JIP1 pour son recrutement par KLC et 3) le mode d’interaction de JIP1 par KLC. Sur la base de ces données, je discuterai les bases structurales du mode d’interaction de KLC avec JIP1 et le comparerai à celui de KLC avec les cargos à motif WD, comme SKIP et Alcadéine-α. / AbstractKinesins are molecular motors involved in the intracellular transport of many cargos within the cell. Although the motility of kinesins is well understood, the molecular mechanisms underlying cargo recruitment are much less so.Kinesin1 plays various roles in neuronal cells, where it contributes to the spatial and temporal organization of many cellular components. It would play a role in various neurological pathologies, such as Alzheimer's disease. Understanding how kinesin1 recognizes and interacts with its cargos is important to decorticate its role, as well as that of its cargos, in normal and pathological cells. Kinesin1 is a heterotetramer consisting of two heavy chains (KHC) and two light chains (KLC), both of which are capable of recruiting cargo proteins. One of the first cargo proteins to have been identified is JIP1 (JNK-interacting protein 1) which is: (i) a scaffold protein for the signaling pathway of MAP kinases and (ii) an adaptor protein for transporting amyloid precursor protein (APP) responsible for Alzheimer's disease. In both cases, JIP1 regulates critical processes at the cell level, making it an interesting protein to study. Early studies have led to a better understanding of how JIP1 is recruited and transported by kinesin1. However, the detail of the interaction between KLC and JIP1 is not yet fully described and therefore understood.Objectives: My doctoral work aims at characterizing at the molecular level the interaction between KLC and JIP1. To do this, I had the following objectives: 1) to characterize the interaction domains of the two proteins alone, 2) to study the formation of the complex in solution by biophysical approaches, and 3) to determine the 3D structure of the complex by crystallography.Results: Initially, I characterized the TPR domain of KLC alone, contributing among others to the development of a molecular toolbox. I also participated in the determination of two crystallographic structures of the TPR domain of KLC1/2 that highlights the structural plasticity of the first helix of this domain (Nguyen et al, submitted). In a second step, I set up the conditions for the expression and purification of the PTB domain of JIP1 and carry out the structural characterization of this domain in solution. Although this domain of JIP1 is not necessary for interaction with KLC, I studied the impact of its presence on recruitment by KLC. Finally, I characterized the recruitment of JIP1 by KLC by confirming a number of information on the interaction between the KLC-TPR and the C-terminal region (Cter) of JIP1 at the molecular level. The numerous crystallization tests that I carried out did not make it possible to obtain crystals of the KLC: JIP1 complex. However, I was able to precisely map the interaction zone of JIP1-Cter with the KLC-TPR domain using the various KLC tools available by determining by ITC their affinity with JIP1-Cter (Nguyen et al., In preparation ).Conclusion: Thus, my PhD work allowed to better understand 1) the structural versatility of the KLC-TPR domain, 2) the impact of the JIP1-PTB domain for its KLC recruitment, and 3) the interaction mode of JIP1 by KLC . On the basis of these data, I will discuss the structural basis of the mode of binding of KLC with JIP1 and compare it with that of KLC with WD-motif cargo, such as SKIP and Alcadein-α.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2017SACLS250 |
| Date | 16 October 2017 |
| Creators | Nguyen, The Quyen |
| Contributors | Université Paris-Saclay (ComUE), Menetrey, Julie, Llinas, Paola |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
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