Dans la nature, les micro-organismes sont organisés en communautés agrégées dénommées biofilms, particulièrement adaptées à la survie en milieu hostile. Les difficultés pour prévenir la formation ou éliminer des biofilms matures par des stratégies conventionnelles ont encouragé le développement de nouvelles approches inspirées des mécanismes de compétition entre différents micro-organismes au sein de biofilms naturels. Au cours de ce travail, nous nous sommes intéressés à l'effet anti-biofilm de bactéries bénéfiques appartenant aux genres Lactobacillus et Bifidobacterium. Dans un premier temps, nous avons testé l'effet anti-biofilm de surnageants neutralisés vis-à-vis de deux pathogènes Klebsiella pneumoniae et Staphylococcus epidermidis dans un modèle expérimental statique. Si les extraits des quelques souches de Bifidobacterium testées stimulaient la formation de biofilm par K. pneumoniae sur surface abiotique, la majorité de ceux des 140 souches de Lactobacillus exerçait un effet inhibiteur et nous avons retenu une des souches dont le surnageant de culture entraînait une inhibition majeure (70%), Lactobacillus plantarum CIRM653. Cet extrait s'est également avéré capable de disperser des biofilms préformés à K. pneumoniae sur surface abiotique mais aussi d’inhiber la formation de biofilms sur surface biotique, et ce indépendamment d’un effet bactéricide. La formation de biofilms mixtes formés par L. plantarum et K. pneumoniae dans des modèles expérimentaux cinétiques a permis, comparativement à l'observation de biofilms mono-espèce à K. pneumoniae, de mettre en évidence des défauts de structuration du biofilm associés à une diminution de la biomasse de K. pneumoniae et une augmentation de celle de L. plantarum. Grâce à une approche transcriptionnelle ciblée, nous avons montré que L. plantarum induisait, par le biais de son surnageant, des modifications de l’expression de gènes impliqués dans la formation de biofilm chez K. pneumoniae. Quatre gènes impliqués dans le quorum-sensing (opérons lsr) étaient sous-exprimés et trois gènes de structure du pilus de type 3 étaient sur-exprimés. L'augmentation de la production de pili de type 3 fonctionnels a été validée par Western-blot et des tests d’hémagglutination. Cette surexpression est probablement responsable du niveau élevé des capacités d’adhésion sur surface abiotique d'agrégats de K. pneumoniae issus de la dispersion induite par L. plantarum.Le comportement des deux souches a également été testé in vivo, dans un modèle murin de colonisation intestinale par K. pneumoniae avec administration orale quotidienne de L. plantarum. Le dénombrement du pathogène dans les selles des animaux a montré qu'en présence de L. plantarum, K. pneumoniae maintient des niveaux de colonisation élevés, contrairement au contrôle (sans Lactobacillus) où une diminution graduelle est observée.Enfin, nous avons initié le développement d'un modèle expérimental tripartite permettant d'associer les deux partenaires bactériens avec des cellules épithéliales dans un système en flux continu. La réponse spécifique des cellules eucaryotes a également été abordée : nous avons pu mettre en évidence que L. plantarum exerçait un effet inhibiteur vis-à-vis de la réponse inflammatoire épithéliale pulmonaire induite par K. pneumoniae. En conclusion, la description d'une activité anti-biofilm in vitro ne serait pas synonyme d'une réduction in vivo de la colonisation de surfaces biotiques, mais à une plus grande capacité de dissémination. Ces observations démontrent l’importance d’une expertise précise de l’action des bactéries bénéfiques et de la maitrise du ratio bénéfice-risque pour leur utilisation. / In the natural environment microorganisms are organized in aggregated communities called biofilms, which are particularly adapted to the survival in harsh conditions. The difficulties to prevent the formation or elimination of mature biofilms by conventional strategies have encouraged the development of new approaches inspired by competition mechanisms occurring between microorganisms within natural biofilms.In this work, we looked for anti-biofilm effects of beneficial bacteria belonging to Lactobacillus and Bifidobacterium genus. We first tested the anti-biofilm effect of neutralized supernatants against both pathogens Klebsiella pneumoniae and Staphylococcus epidermidis in a static experimental model. The few Bifidobacterium extracts tested led to an increase in biofilm formation by K. pneumoniae on abiotic surface, whereas the majority of the 140 strains of Lactobacillus exerted an inhibitory effect. Lactobacillus plantarum CIRM653 was selected for further experiments because its culture supernatant displayed major inhibition (70%). This extract was also capable of dispersing preformed biofilms of K. pneumoniae on abiotic surface, but also able to inhibit biofilm formation on biotic surface, independently of a bactericidal effect. The formation of mixed biofilm containing L. plantarum and K. pneumoniae in kinetic experimental models highlighted the biofilm structure defects associated with a decrease of K. pneumoniae biomass and an increase of that of L. plantarum, compared to a monospecies K. pneumoniae biofilm. Targeted transcriptional approach was used to assess changes in the expression of genes involved in biofilm formation by K. pneumoniae after contact with L. plantarum supernatant. Four genes involved in quorum-sensing (operons lsr) were under-expressed and three type 3 pili structural genes were over-expressed. The increase of functional surface located type 3 pili was validated by Western blotting and hemagglutination tests. This overexpression was probably responsible for the observed high level of adhesion capacity to abiotic surfaces of K. pneumoniae aggregates recovered after dispersion induced by L. plantarum.The behavior of the two strains was also tested in vivo in a K. pneumoniae murine intestinal colonization model with daily oral administration of L. plantarum. Viable cells counting of the pathogen in the animals’ feces showed that K. pneumoniae maintained high levels of colonization in the presence of L. plantarum, unlike the control (without Lactobacillus) where a gradual decrease was observed.Finally, we initiated the development of a tripartite experimental model allowing the combination of the two bacterial partners with epithelial cells in a continuous flow system. In parallel, the specific response of eukaryotic cells to these bacteria was addressed: L. plantarum exerted an inhibitory effect on the pulmonary epithelial inflammatory response induced by K. pneumoniae.In conclusion, these results highlight the discrepancy between in vitro anti-biofilm activity of L. plantarum and its in vivo behavior leading to increased dissemination of the pathogen. Substantial expertise of beneficial bacteria is therefore necessary to fully assess their benefit-risk ratio.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2016CLF1PP03 |
| Date | 28 September 2016 |
| Creators | Lagrafeuille, Rosyne |
| Contributors | Clermont-Ferrand 1, Forestier, Christiane |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
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