Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Introduction: HPV infection is the most common sexually transmitted disease in
humans, which can cause benign diseases (warty lesion) or malignant as the
anogenital cancer, oral cancer and, with the highest incidence, cervical cancer.
Overall, the main HPV detection method is based on cytological evaluation of
Papanicolaou; however, false-negative results and unsatisfactory sampling
complicate the disease diagnosis and prevention. In this context, the investigation
of new diagnosis platforms and prophylaxys has great interest.
Objectives: The aim of this study was to conduct an epidemiological study of HPV
infection in the women population of southeastern Brazil and then propose new
diagnostic and vaccine approaches.
Methodology: Genital samples of 5,223 women were evaluated by a new
molecular tool based on PCR (Nested Multiplex PCR - NMPCR), using a cocktail
of primers for simultaneous detection of 38 different HPV types, in single tube.
Another molecular approach was proposed by Phage Display technique to select
the IgA binding peptides from cervical samples of patients with HPV infection. In
silico (Linear and 3D bioinformatics) and in vitro (ELISA, Slot blot and
Bioelectrode) analysis were performed to validate the selected phages and
synthetic peptides in cervical (n=91) and salivary specimens (n=66). The
sensitivity and specificity parameters of HPV diagnosis were determined by ROC
curve. To test the vaccine potential of synthetic peptides, in silico (3D
bioinformatic), in vivo (female BALB/c mice immunization) or in vitro analyzes
(MTT, ELISA, splenocytes culture, CBA and Neutralization assay) were carried
out.
Results: Among the 5,223 women evaluated, there was a prevalence of 58.9% of
HPV infection, especially the types 53, 52 and 06, showing the relevance to
propose new alternatives for HPV detection and prevention. In molecular approach
of Phage Display, thirty-two distinct phage clones were selected against IgA from
positive HPV cervical samples. Phage C.B1 showed higher reactivity against HPV
samples compared to the negative control group by ELISA. This peptide is a
putative epitope of HPV major capsid protein (L1) and has distinguished efficiently
infection from HPV controls in cervical and saliva samples (p <0.0001), with high sensitivity (above 95%) and specificity (above 71%) in both fluids. The C.B1
peptide was also successfully incorporated (p<0.05) onto a graphite bioelectrode
for HPV direct diagnosis in saliva. In the vaccine approach, three peptides (PEP1,
PEP3 and PEP4) showed no toxicity in murine macrophages. Immunizations
showed potent induction of serum IgG antibodies production by PEP3, and
increase in IgA titer in the vaginal mucosa under PEP1 and PEP3 stimuli. The
evaluation of cellular immune response indicated that the PEP1 and, particularly,
the PEP3 chimeric peptide were able to polarize the immune response towards to
Th1 profile and sensitize the cells to a pro-inflammatory \"status\", suitable for
antiviral activity. The HPV-16 PsVs neutralization assay showed that PEP3 was
able to reduce the infection by 49%.
Conclusions: Overall, the studies presented here showed a high prevalence of
HPV among Brazilian women by viral types still little explored in the literature. We
selected mimotopes by Phage Display tool capable of detecting HPV in both saliva
samples as in the cervical secretion, providing a low cost, simple and non-invasive
diagnostics for population screening. In addition, the mimotopes selected have
attractive applicability in vaccine formulations, but further studies are still needed. / Introdução: A infecção por HPV é a doença sexualmente transmissível mais
comum em humanos, que pode causar doenças benignas (lesões verrucosas) ou
malignas como o câncer anogenital, câncer oral e, com maior incidência, o câncer
do colo uterino. Globalmente, o principal método de detecção do HPV baseia-se
na avaliação citopatológica de Papanicolaou, entretanto, resultados falsonegativos
e obtenção de amostras insatisfatórias dificultam o diagnóstico e a
prevenção da doença. Neste contexto, a busca por novas plataformas
diagnósticas e profiláticas para o HPV é de grande interesse.
Objetivos: O objetivo do presente estudo foi realizar um levantamento
epidemiológico da infecção por HPV na populacão feminina da região Sudeste do
Brasil e, a partir de então, propor novas abordagens diagnósticas e vacinais.
Metodologia: Amostras genitais de 5.223 mulheres foram avaliadas por uma
nova ferramenta molecular baseada em PCR (Nested Multiplex PCR - NMPCR),
utilizando-se um coquetel de primers para detecção simultânea de 38 diferentes
tipos virais de HPV, em um único tubo. Outra abordagem molecular foi proposta
através da técnica de Phage Display, a fim de selecionar peptídeos ligantes a
anticorpos IgA oriundos de amostras cervicas de pacientes com infecção por
HPV. Análises in silico (Bioinformática linear e 3D) e in vitro (ELISA, Slot blot e
Bioeletrodo) foram realizadas para a validação dos fagos selecionados e dos
peptídeos sintetizados em espécimes cervicais (n=91) e salivares (n=66). Os
parâmetros de sensibilidade e especificidade do diagnóstico do HPV foram
determinados pela curva ROC. Para testar o potencial vacinal dos peptídeos
sintéticos, análises in silico (Bioinformática 3D), in vivo (imunização em
camundongos fêmeas BALB/c) e in vitro (MTT, ELISA, Cultura de esplenócitos,
CBA e Ensaio de Neutralização) foram conduzidas.
Resultados: Dentre as 5.223 mulheres avaliadas, houve uma prevalência de
58,9% de infecção por HPV, com predominância dos tipos 53, 52 e 06,
evidenciando a relevância de se propor novas alternativas de detecção e
profilaxia do HPV. Na abordagem molecular de Phage Display trinta e dois clones
de fagos distintos foram selecionados contra a IgA de amostras cervicais positivas
para o HPV. O fago C.B1 apresentou maior reatividade contra amostras de HPV
em comparação ao grupo controle negativo, por ELISA. Este peptídeo é um epítopo putativo da proteína principal do capsídeo do HPV (L1) e tem
discriminado eficientemente amostras HPV de controles, em amostras cervicais e
salivares (p<0,0001); com alta sensibilidade (acima de 95%) e especificidade
(acima de 71%) em ambos fluidos. O peptídeo C.B1 também foi incorporado com
sucesso (p<0,05) em um bioeletrodo de grafite para o diagnóstico do HPV direto
na saliva. Na abordagem vacinal, três peptídeos (PEP1, PEP3 e PEP4) não
apresentaram toxicidade em macrófagos murinos. As imunizações revelaram
potente indução na produção de anticorpos séricos IgG pelo PEP3, e aumento
nos títulos de IgA na mucosa vaginal sob estímulo dos PEP1 e PEP3. A avaliação
da resposta imune celular indicou que o PEP1 e, sobretudo o peptídeo quimérico
PEP3, foram capazes de polarizar a resposta imune para o perfil Th1 e
sensibilizar as células a um status pró-inflamatório, propício para atuação
antiviral. O ensaio de neutralização de PsVs do HPV-16 mostrou que o PEP3 foi
capaz de reduzir a infecção em 49%.
Conclusões: De maneira geral, os estudos aqui apresentados evidenciaram uma
alta prevalência de HPV em mulheres brasileiras por tipos virais ainda pouco
explorados na literatura mundial. Nós selecionamos mimotopos pela ferramenta
de Phage Display capazes de detectar o HPV tanto em amostras de saliva quanto
em secreção cervical, possibilitando um diagnóstico simples, de baixo custo, e
não invasivo para rastreios populacionais. Além disso, os mimotopos aqui
selecionados possuem atraente aplicabilidade em formulações vacinais, porém
estudos adicionais ainda são necessários. / Doutor em Genética e Bioquímica
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/urn:repox.ist.utl.pt:RI_UFU:oai:repositorio.ufu.br:123456789/15762 |
| Date | 03 September 2015 |
| Creators | Matias, Bruna França |
| Contributors | Marangoni, Karina, Goulart Filho, Luiz Ricardo, Faria, Ana Maria Caetano de, Jardim, Ana Carolina Gomes, Nascimento, Rafael, Teixeira, David Nascimento Silva, Cunha Junior, Jair Pereira da |
| Publisher | Universidade Federal de Uberlândia, Programa de Pós-graduação em Genética e Bioquímica, UFU, BR, Ciências Biológicas |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFU, instname:Universidade Federal de Uberlândia, instacron:UFU |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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