La Tripanosomiasis americana es el problema sanitario más relevante de la Argentina, afectando cerca de 1,6 millones de personas. La Organización Mundial de la Salud considera a la enfermedad de Chagas como uno de los mayores flagelos de América Latina: unas 18 millones de personas sufren sus consecuencias y 120 millones están en riesgo de infección. Si bien esta enfermedad se distribuye principalmente en América Latina, en las últimas décadas se ha observado con mayor frecuencia en los Estados Unidos, Canadá, muchos países europeos y algunos del Pacífico Occidental.
Hasta hoy, el control de esta enfermedad, se basa exclusivamente en insecticidas que acarrean múltiples problemas en cuanto a su incorrecta aplicación y baja selectividad, debido a que eliminan tanto enemigos naturales de los triatominos como otras especies benéficas para el hombre, produciendo un gran deterioro en el medio ambiente, provocando todo esto que los insectos sean cada vez más resistentes a los insecticidas aplicados.
La introducción o el incremento de enemigos naturales en poblaciones naturales de las principales especies transmisoras de Chagas, puede lograr con el tiempo la reducción del número de vectores a niveles que aseguren la interrupción de la transmisión del parásito en la población susceptible. Cabe destacar que los aspectos negativos en las campañas de rociado y la perspectiva que esas dificultades se agraven, ha motivado a que la búsqueda de nuevos métodos de control de triatominos de domicilio y peridomicilio haya sido identificada como un área prioritaria de investigación por la Organización Mundial de la Salud.
El Triatoma virus (TrV) es el único virus entomopatógeno identificado en triatominos hasta el momento. Existen observaciones que sustentarían el uso de TrV como control biológico. Muscio en 1997, registró porcentajes superiores a 90% de mortalidad en el laboratorio en estados ninfales de T. infestans infectados con TrV. Además, Rozas-Dennis y Cazzaniga en el 2000, observaron que la infección con TrV reduce la longevidad y la fecundidad de las hembras adultas, y que las ninfas infectadas muestran parálisis en las patas y dificultad para desprenderse de la exuvia.
De acuerdo al Comité Internacional de Taxonomía Viral (ICTV), TrV pertenece a la familia Dicistroviridae cuya especie tipo es el virus de la parálisis del grillo, con un único género: Cripavirus. Es un virus ARN de hebra simple y sentido positivo, con una longitud de 9.010 bases y una masa molecular teórica de 2.886,4 KDa. La composición de los viriones de TrV es 35% de ARN y 65% de proteínas. El genoma posee dos marcos abiertos de lectura denominados ORF1 y ORF2 que codifican las proteínas no estructurales y de la cápside respectivamente; separados por una región intergénica (IGR).
De acuerdo a los estudios realizados hasta el momento, TrV puede transmitirse principalmente por vía horizontal, mediante la ruta fecal-oral, como así también por una vía vertical (transovárica). Su distribución en la naturaleza se restringe solamente a T. infestans y T. sordida. Hasta el momento no se conocen estudios inherentes a la búsqueda de TrV en Latinoamérica: al presente solo se ha encontrado en Argentina.
El objetivo central de este trabajo fue, por un lado estudiar la diversidad de TrV en triatominos de nuestro país; y obtener un sistema para la replicación de TrV in vitro. Así, se analizaron triatominos de 10 provincias argentinas desde el 2008 hasta el 2011, resultando un total de 1632 ejemplares pertenecientes a 10 especies de domicilio, peridomicilio y ambiente silvestre: T. infestans, T. guasayana, T. delpontei, T. breyeri, T. eraturysiforme, T. sordida, T. platensis, T. garciabesi, Panstrongylus guentheri y Psammolestes coreodes. Las especies anteriormente mencionadas fueron capturadas en viajes de campaña, obtenidas del material conservado en la colección de nuestro laboratorio o enviadas de otros centros de referencia. A todos los insectos se les extrajo la materia fecal para luego extraerle ARN y finalmente analizarlas mediante RT-PCR. Los resultados positivos resultantes de la RT-PCR fueron 29. Estos productos resultantes se purificaron, cuantificaron y se enviaron a secuenciar. El análisis de las muestras secuenciadas no mostraron variabilidad genómica significativa. Esto se vio reflejado tanto a nivel específico, como de hábitat y distribución geográfica de los triatominos.
Contar con líneas o cultivos celulares sensibles a la infección con TrV podría traer grandes ventajas. Permitir aislar, caracterizar y estudiar en profundidad la biología del virus nos permitiría obtener masa viral, siendo una herramienta fundamental para su posible uso como agente de control biológico. Si bien, no se conocen líneas celulares susceptibles a TrV, se intentó su replicación en líneas de dípteros y lepidópteros. Se desconoce además, si el virus producirá efecto citopático visible en las células.
Con respecto a este otro gran objetivo general, se intentó la replicación de TrV en cultivos celulares. Por un lado, en líneas celulares de insecto, por medio de distintos métodos: transfección, electroporación, inoculación con tripsina y con virus purificado. Por otro lado se intentó obtener cultivo primario de vinchucas sanas. Para esto se utilizaron triatominos de la colonia de nuestro laboratorio. Los sustratos para la realización del cultivo primario fueron embriones y adultos (con y sin tripsina y explantos); además se inocularon huevos embrionados. Para todos los métodos y ensayos descriptos anteriormente, se utilizaron técnicas de SDS-PAGE, Western Blot (WB), Inmunofluorescencia indirecta (IFI) o bien RT-PCR para confirmar la presencia del TrV en las células. Para evaluar el líquido alantoideo se utilizó la técnica de Hemaglutinación (HA). No fue posible la replicación in vitro de TrV en líneas celulares de dípteros (C6/36) y lepidópteros (SF9, SF21, HighFive). Tampoco fue posible obtener un clon celular partiendo de tejidos adultos o embrionarios de vinchucas sanas. En cuanto a la presencia de virus en líquido alantoideo por HA, en ningún caso se obtuvo resultado positivo, ni tampoco utilizando sobrenadantes supuestamente infectados. Sin embargo el virus TrV purificado utilizado como control, aglutinó los glóbulos rojos de pollo. En las pruebas complementarias de Microscopia electrónica, SDS-PAGE, WB, IFI, RT-PCR tampoco obtuvimos resultados satisfactorios.
Este trabajo de tesis, representa uno de los estudios más amplios realizado hasta el presente en TrV de triatominos en Argentina.
El registro de este virus es de alta importancia, debido a que de las tres vías posibles de contagio de la enfermedad de Chagas, la vectorial es la predominante en el área endémica, siendo imprescindible profundizar aún más en el conocimiento de los insectos huéspedes para optimizar su control.
Los resultados de esta labor, amplían considerablemente la información existente sobre este virus en Argentina, siendo de suma importancia además para el resto de los países afectados por la enfermedad. Si bien no fue posible la replicación del virus in vitro, nada se conocía al respecto sobre TrV. Es por ello que se intentará su replicación en líneas celulares de hemípteros, donde se han citado resultados exitosos en virus muy cercanos filogenéticamente. Se esbozan datos novedosos sobre la distribución geográfica y de ambiente; hospedero y variabilidad genómica de las especies analizadas. Si bien no ha sido uno de los objetivos de este trabajo de tesis, el desarrollo de la misma, permitió ampliar el estudio del virus para poder llegar a utilizarlo en un futuro inmediato, como ya se ha mencionado, como agente de control biológico.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:SEDICI/oai:sedici.unlp.edu.ar:10915/26163 |
| Date | 22 March 2013 |
| Creators | Susevich, María Laura |
| Contributors | Echeverría, María Gabriela, Martí, Gerardo Aníbal |
| Source Sets | Universidad Nacional de La Plata, Sedici |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | Tesis, Tesis de doctorado |
| Rights | http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/2.5/ar/, Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivs 2.5 Argentina (CC BY-NC-ND 2.5) |
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