O fungo Humicola grisea var. thermoidea foi submetido a diferentes condições de cultivo com o intuito de determinarem-se as melhores condições para produção de conídios, crescimento e produção de metabólitos secundários com atividade biológica. Para tal foram desenvolvidos experimentos avaliando dois parâmetros: meio fermentativo e tempo de incubação. Os meios fermentativos líquidos utilizados foram Czapek, Jackson e Vogel em condições de agitação (120 rpm), e os tempos avaliados foram 72, 96, 120, 144, 168 e 192 horas. Também foi desenvolvida cultura por fermentação em substrato sólido, meio de arroz enriquecido, em diferentes tempos de incubação, sendo escolhido o período de 60 e 90 dias como os mais promissores. Todos os cultivos foram realizados em temperatura de 40ºC. Dos cultivos em meio líquido foram obtidos extratos acetoetílicos e butanólicos dos filtrados das culturas e metanólicos dos micélios. Dos cultivos a partir do meio sólido foram obtidos extratos acetoetílicos. Os extratos foram avaliados pela técnica de bioautografia na concentração de 30 mg/mL (10 L), utilizando-se como indicadores biológicos as cepas Kocuria rhizophila (ATCC 9341), Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Escherichia coli (ATCC 25922) e Pseudomonas aeruginosa (ATCC 14885). Os extratos acetoetílicos e metanólicos obtidos a partir dos cultivos em Czapek e Vogel, nos tempos 144, 168 e 192 horas se mostraram ativos contra as cepas K. rhizophila e S. aureus. Os extratos obtidos do meio sólido e o extrato acetoetílico (192 horas) obtido do meio de cultivo de Czapek foram avaliados pelo método de microdiluição em microplaca com o objetivo de determinarem-se os valores de CIM, utilizando como microrganismos indicadores K. rhizophila e S. aureus. O extrato mais promissor foi o extrato acetoetílico do cultivo em meio de arroz enriquecido, durante 90 dias, sendo os valores de concentração inibitória mínima de 350 g/mL e de 250 g/mL, contra S. aureus e K. rhizophila, respectivamente. Os extratos foram avaliados por cromatografia líquida de alta eficiência, sendo a princípio considerados promissores os extratos em acetato de etila de Czapek e arroz enriquecido. O fungo foi cultivado em arroz (60 e 90 dias), devido ao maior rendimento, manejo mais simples, menores valores de concentração inibitória mínima quando comparados aos cultivos desenvolvidos nos meios fermentativos líquidos avaliados. Deste modo, foi promovida ampliação da escala de cultivo em meio sólido e os extratos obtidos foram submetidos a processos cromatográficos visando o isolamento de substâncias ativas. Foram isoladas seis substâncias, e elucidadas três: dimetil tereftalato, ácido p-hidroxifenilacético e uma lactama, a qual foi isolada pela primeira vez de fungos e havia sido isolada apenas da esponja marinha (Halichondria melanodocia) infestada por alga. Os resultados dos ensaios de microdiluição em microplaca de tais substâncias se mostraram bastante discretos. Entretanto, outros ensaios biológicos, dentre eles, antitumorais e antiparasitários serão realizados para as substâncias isoladas. / The fungos Humicola grisea var. thermoidea was submmited to different growth conditions, aiming to determine the best condition for the conidia production, mycelia growth and production of secondary metabolites bearing biological activities, as well. For that, it was evaluated both deferent fermentative media (Czapek, Jackson and Vogel) and incubation time (72, 96, 120, 144, 168 e 192 hours), under 120 RPM. The fungus was also cultivated in solid medium using enriched rice in different times of incubation in two batches of 60 and 90 days of fermentation. All fermentations were undertaken at 40ºC. From the fermetation in liquid media it was obtained the extracts in ethyl acetate and n- butanol, from the broth, respectively, and in methanol from the mycelium. From the solid media (rice) it was obtained the ethyl acetate extract. The obtained extracts were submitted to bioautography assay by applying 10 L of a solution containing 30 mg/mL of each extract against the following bacteria strains: Kocuria rhizophila (ATCC 9341), Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Escherichia coli (ATCC 25922) and Pseudomonas aeruginosa (ATCC 14885). The extracts em ethyl acetate and methanol obtained from from Czapek and Vogel media at 144, 168 e 192 hours displayed activity against K. rhizophila and S. aureus. The extracts obtained from the solid medium and the ethyl acetate extract from the Czapek nediun at 192 hours were evaluated using the Minimum Inhibitory Concentration (MIC) in microplates, aiming to determine the MIC values for these extracts against both K. rhizophila and S. aureus. The most active extract (ethyl acetate) was the one obtained from solid media cultivated for 90 days, furnishing the MIC values of 350 g/mL and 250 g/mL against S. aureus and K. rhizophila, respectively. All the obtained extracts were submitted to HPLC chromatography and the best chromatographic profiles were displayed by both ethyl acetate extracts from Czapek and enriched rice media. The cultivation in rice media was simple and produced the highest yield of extract, as well as displayed the lowest CIM in comparison with the extracts obtained from the broth of liquid media. Therefore, the fungus was cultivated in a larger scale in rice aiming to obtain enough amount of ethyl acetate extract to allow the isolation of the major active compounds by chromatographic means. Thus, six compounds were isolated, from which three were identified so far: dimethyl tereftalate, p-hidroxyphenylacetic acid and the one lactam. The lactam was isolated for the firs time from a soil fungus, and it was previous isolated only from a marine sponge (Halichondria melanodocia) infested by algae. However, the obtained MIC values for these compounds were very high. Even though, other biological assays, such as: anticancer and antiparasitic, among other will be undertaken to evaluate the potential of the isolated compounds.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:teses.usp.br:tde-02102008-164728 |
| Date | 27 February 2008 |
| Creators | Willian Jonis Andrioli |
| Contributors | Jairo Kenupp Bastos, Luis Henrique Souza Guimarães, Maria de Lourdes Teixeira de Moraes Polizeli |
| Publisher | Universidade de São Paulo, Ciências Farmacêuticas, USP, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP, instname:Universidade de São Paulo, instacron:USP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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