A cana-de-açúcar é uma cultura economicamente importante, cultivada especialmente pelo seu colmo, que constitui a matéria-prima para produtos como o açúcar e o bioetanol. Ademais, a compreensão do proteoma nuclear é essencial para decifrar os mecanismos que governam a regulação gênica. No presente estudo, é demonstrado o isolamento e a identificação através de 1D SDS-PAGE de proteínas nucleares originadas de folhas jovens de plantas de cana-de-açúcar. Os núcleos foram isolados de folhas F+1 frescas de cana-de-açúcar de 1 e 4 meses, usando o protocolo modificado de Folta e Kaufman (2000). O experimento consistiu em um delineamento inteiramente casualizado, com três repetições de 18 plantas cada. Após a purificação usando o gradiente de percoll, a integridade do núcleo foi avaliada por meio da coloração com orceína acetolática 1% e com DAPI. Os resultados obtidos revelam os núcleos como esferas uniformes com o diâmetro médio de 5 ?m. As proteínas nucleares foram isoladas usando o reagente TRI Reagent (Sigma) e quantificadas por meio do método de Bradford. As análises de Western blot foram usadas para demonstrar o enriquecimento de proteínas nucleares. As membranas foram incubadas com a RUBISCO, PEPCase, OEE1, Histona e PCNA. A presença da PCNA e da Histona foram detectadas apenas no extrato de proteínas nucleares, já a RUBISCO, a PEPCase e a OEE1 foram detectadas de forma abundante no extrato de proteínas total e reduzida na fração nuclear. Para a caracterização do proteoma nuclear, 60 ?g de proteínas foram separadas por SDS-PAGE e cada canaleta dividida em 20 bandas. As proteínas de cada banda foram digeridas e purificadas. A identificação foi realizada por meio de espectrometria de massas (Synapt G2 HDMS) e analisadas usando o ProteinLynx e o banco de dados SUCEST. Programas como BaCelLo, WoLF PSORT, Plant-mPloc, SherLoc e PSORT foram usados para a predição da localização subcelular das proteínas identificadas. A classe de proteínas identificadas mais abundante se relaciona à montagem de nucleossomos, e é representada principalmente pelas histonas, como H2A.2, H2A.8, H3.3, H2B.1, H2B.2, dentre outras. Ademais, ainda foram encontradas classes menos abundantes relacionadas ao metabolismo do DNA, do RNA, regulação da transcrição, dentre outras. Alguns fatores de transcrição e outras proteínas nucleares típicas também foram identificadas, porém, possivelmente em decorrência de sua baixa abundância, não foram observados em todas as repetições. Os resultados encontrados mostram a aplicabilidade da metodologia para criar um perfil preciso do proteoma nuclear de cana-de-açúcar. / Sugarcane is a cash crop, cultivated for its stalks which accumulate sucrose, the raw material for products like sugar and bioethanol. Nuclear proteome comprehension is essential for deciphering the mechanisms that governs genome regulation and function. In the present study, we report the isolation and identification by 1D SDS-PAGE of nuclear proteins from young sugarcane leaves. The nuclei were isolated from fresh tissue of one and four-month-old sugarcane F+1 leaves, using the modified protocol of Folta and Kaufman (2000). The experiment consisted on a completely randomized design, three biological repetitions each with 18 plants. After purification using a percoll gradient, nucleus integrity was evaluated by staining with 1% acetolactic orcein and with DAPI. The results obtained reveal nuclei as uniform spheres with an average diameter of 5 ?m. The nuclear proteins were isolated using TRI Reagent (Sigma) and quantified by Bradford. Western blot analysis were used to prove enrichment for nuclear proteins. Membranes were incubated with RUBISCO, PEPCase, OEE1, Histone and PCNA. The presence of PCNA and Histone were detected only in the nuclear fraction. RUBISCO, PEPCase and OEE1 were very abundant in the total protein fraction and reduced in the nuclear fraction. For the characterization of nuclear proteome, 60 ?g of proteins were separated by SDSPAGE and each lane divided into 20 sections, the proteins from each section were digested and purified. Protein identification was carried out by mass spectrometry (Synapt G2 HDMS) and analyzed using ProteinLynx and SUCEST database. Softwares, such as BaCelLo, WoLF PSORT, Plant-mPloc, SherLoc and PSORT were also used to predict the subcelular localization of the identified proteins. The most abundant protein class is related to the nucleosome assembly. It is represented specially by histones like H2A.2, H2A.8, H3.3, H2B.1, H2B.2, among others. Besides, less abundant classes like the ones related to DNA and RNA metabolism, regulation of transcription and others were also found. Some transcription factors and other typical nuclear proteins were identified as well, but, possibly due to their low abundance, they were not observed in all three repetitions. These results show the applicability of this method to create an accurate sugarcane nuclear proteome profile.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-29112012-144814 |
| Date | 26 October 2012 |
| Creators | Silva, Danielle Izilda Rodrigues da |
| Contributors | Labate, Carlos Alberto |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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