A cana-de-açúcar é uma cultura economicamente importante, cultivada especialmente pelo seu colmo, que constitui a matéria-prima para produtos como o açúcar e o bioetanol. Ademais, a compreensão do proteoma nuclear é essencial para decifrar os mecanismos que governam a regulação gênica. No presente estudo, é demonstrado o isolamento e a identificação através de 1D SDS-PAGE de proteínas nucleares originadas de folhas jovens de plantas de cana-de-açúcar. Os núcleos foram isolados de folhas F+1 frescas de cana-de-açúcar de 1 e 4 meses, usando o protocolo modificado de Folta e Kaufman (2000). O experimento consistiu em um delineamento inteiramente casualizado, com três repetições de 18 plantas cada. Após a purificação usando o gradiente de percoll, a integridade do núcleo foi avaliada por meio da coloração com orceína acetolática 1% e com DAPI. Os resultados obtidos revelam os núcleos como esferas uniformes com o diâmetro médio de 5 ?m. As proteínas nucleares foram isoladas usando o reagente TRI Reagent (Sigma) e quantificadas por meio do método de Bradford. As análises de Western blot foram usadas para demonstrar o enriquecimento de proteínas nucleares. As membranas foram incubadas com a RUBISCO, PEPCase, OEE1, Histona e PCNA. A presença da PCNA e da Histona foram detectadas apenas no extrato de proteínas nucleares, já a RUBISCO, a PEPCase e a OEE1 foram detectadas de forma abundante no extrato de proteínas total e reduzida na fração nuclear. Para a caracterização do proteoma nuclear, 60 ?g de proteínas foram separadas por SDS-PAGE e cada canaleta dividida em 20 bandas. As proteínas de cada banda foram digeridas e purificadas. A identificação foi realizada por meio de espectrometria de massas (Synapt G2 HDMS) e analisadas usando o ProteinLynx e o banco de dados SUCEST. Programas como BaCelLo, WoLF PSORT, Plant-mPloc, SherLoc e PSORT foram usados para a predição da localização subcelular das proteínas identificadas. A classe de proteínas identificadas mais abundante se relaciona à montagem de nucleossomos, e é representada principalmente pelas histonas, como H2A.2, H2A.8, H3.3, H2B.1, H2B.2, dentre outras. Ademais, ainda foram encontradas classes menos abundantes relacionadas ao metabolismo do DNA, do RNA, regulação da transcrição, dentre outras. Alguns fatores de transcrição e outras proteínas nucleares típicas também foram identificadas, porém, possivelmente em decorrência de sua baixa abundância, não foram observados em todas as repetições. Os resultados encontrados mostram a aplicabilidade da metodologia para criar um perfil preciso do proteoma nuclear de cana-de-açúcar. / Sugarcane is a cash crop, cultivated for its stalks which accumulate sucrose, the raw material for products like sugar and bioethanol. Nuclear proteome comprehension is essential for deciphering the mechanisms that governs genome regulation and function. In the present study, we report the isolation and identification by 1D SDS-PAGE of nuclear proteins from young sugarcane leaves. The nuclei were isolated from fresh tissue of one and four-month-old sugarcane F+1 leaves, using the modified protocol of Folta and Kaufman (2000). The experiment consisted on a completely randomized design, three biological repetitions each with 18 plants. After purification using a percoll gradient, nucleus integrity was evaluated by staining with 1% acetolactic orcein and with DAPI. The results obtained reveal nuclei as uniform spheres with an average diameter of 5 ?m. The nuclear proteins were isolated using TRI Reagent (Sigma) and quantified by Bradford. Western blot analysis were used to prove enrichment for nuclear proteins. Membranes were incubated with RUBISCO, PEPCase, OEE1, Histone and PCNA. The presence of PCNA and Histone were detected only in the nuclear fraction. RUBISCO, PEPCase and OEE1 were very abundant in the total protein fraction and reduced in the nuclear fraction. For the characterization of nuclear proteome, 60 ?g of proteins were separated by SDSPAGE and each lane divided into 20 sections, the proteins from each section were digested and purified. Protein identification was carried out by mass spectrometry (Synapt G2 HDMS) and analyzed using ProteinLynx and SUCEST database. Softwares, such as BaCelLo, WoLF PSORT, Plant-mPloc, SherLoc and PSORT were also used to predict the subcelular localization of the identified proteins. The most abundant protein class is related to the nucleosome assembly. It is represented specially by histones like H2A.2, H2A.8, H3.3, H2B.1, H2B.2, among others. Besides, less abundant classes like the ones related to DNA and RNA metabolism, regulation of transcription and others were also found. Some transcription factors and other typical nuclear proteins were identified as well, but, possibly due to their low abundance, they were not observed in all three repetitions. These results show the applicability of this method to create an accurate sugarcane nuclear proteome profile.

A cana-de-açúcar é uma cultura economicamente importante, cultivada especialmente pelo seu colmo, que constitui a matéria-prima para produtos como o açúcar e o bioetanol. Ademais, a compreensão do proteoma nuclear é essencial para decifrar os mecanismos que governam a regulação gênica. No presente estudo, é demonstrado o isolamento e a identificação através de 1D SDS-PAGE de proteínas nucleares originadas de folhas jovens de plantas de cana-de-açúcar. Os núcleos foram isolados de folhas F+1 frescas de cana-de-açúcar de 1 e 4 meses, usando o protocolo modificado de Folta e Kaufman (2000). O experimento consistiu em um delineamento inteiramente casualizado, com três repetições de 18 plantas cada. Após a purificação usando o gradiente de percoll, a integridade do núcleo foi avaliada por meio da coloração com orceína acetolática 1% e com DAPI. Os resultados obtidos revelam os núcleos como esferas uniformes com o diâmetro médio de 5 ?m. As proteínas nucleares foram isoladas usando o reagente TRI Reagent (Sigma) e quantificadas por meio do método de Bradford. As análises de Western blot foram usadas para demonstrar o enriquecimento de proteínas nucleares. As membranas foram incubadas com a RUBISCO, PEPCase, OEE1, Histona e PCNA. A presença da PCNA e da Histona foram detectadas apenas no extrato de proteínas nucleares, já a RUBISCO, a PEPCase e a OEE1 foram detectadas de forma abundante no extrato de proteínas total e reduzida na fração nuclear. Para a caracterização do proteoma nuclear, 60 ?g de proteínas foram separadas por SDS-PAGE e cada canaleta dividida em 20 bandas. As proteínas de cada banda foram digeridas e purificadas. A identificação foi realizada por meio de espectrometria de massas (Synapt G2 HDMS) e analisadas usando o ProteinLynx e o banco de dados SUCEST. Programas como BaCelLo, WoLF PSORT, Plant-mPloc, SherLoc e PSORT foram usados para a predição da localização subcelular das proteínas identificadas. A classe de proteínas identificadas mais abundante se relaciona à montagem de nucleossomos, e é representada principalmente pelas histonas, como H2A.2, H2A.8, H3.3, H2B.1, H2B.2, dentre outras. Ademais, ainda foram encontradas classes menos abundantes relacionadas ao metabolismo do DNA, do RNA, regulação da transcrição, dentre outras. Alguns fatores de transcrição e outras proteínas nucleares típicas também foram identificadas, porém, possivelmente em decorrência de sua baixa abundância, não foram observados em todas as repetições. Os resultados encontrados mostram a aplicabilidade da metodologia para criar um perfil preciso do proteoma nuclear de cana-de-açúcar. / Sugarcane is a cash crop, cultivated for its stalks which accumulate sucrose, the raw material for products like sugar and bioethanol. Nuclear proteome comprehension is essential for deciphering the mechanisms that governs genome regulation and function. In the present study, we report the isolation and identification by 1D SDS-PAGE of nuclear proteins from young sugarcane leaves. The nuclei were isolated from fresh tissue of one and four-month-old sugarcane F+1 leaves, using the modified protocol of Folta and Kaufman (2000). The experiment consisted on a completely randomized design, three biological repetitions each with 18 plants. After purification using a percoll gradient, nucleus integrity was evaluated by staining with 1% acetolactic orcein and with DAPI. The results obtained reveal nuclei as uniform spheres with an average diameter of 5 ?m. The nuclear proteins were isolated using TRI Reagent (Sigma) and quantified by Bradford. Western blot analysis were used to prove enrichment for nuclear proteins. Membranes were incubated with RUBISCO, PEPCase, OEE1, Histone and PCNA. The presence of PCNA and Histone were detected only in the nuclear fraction. RUBISCO, PEPCase and OEE1 were very abundant in the total protein fraction and reduced in the nuclear fraction. For the characterization of nuclear proteome, 60 ?g of proteins were separated by SDSPAGE and each lane divided into 20 sections, the proteins from each section were digested and purified. Protein identification was carried out by mass spectrometry (Synapt G2 HDMS) and analyzed using ProteinLynx and SUCEST database. Softwares, such as BaCelLo, WoLF PSORT, Plant-mPloc, SherLoc and PSORT were also used to predict the subcelular localization of the identified proteins. The most abundant protein class is related to the nucleosome assembly. It is represented specially by histones like H2A.2, H2A.8, H3.3, H2B.1, H2B.2, among others. Besides, less abundant classes like the ones related to DNA and RNA metabolism, regulation of transcription and others were also found. Some transcription factors and other typical nuclear proteins were identified as well, but, possibly due to their low abundance, they were not observed in all three repetitions. These results show the applicability of this method to create an accurate sugarcane nuclear proteome profile.

A transição da adolescência (ADOLESC) para a idade adulta (ADULTO) é caracterizada por uma maturação de comportamentos, assim como de estruturas e sistemas do SNC. Este estudo investigou os efeitos da administração aguda e repetida de baixas doses de etanol (2,0 g/kg) em camundongos ADULTO (60 dias) e ADOLESC (28 dias), bem como a expressão de c-Fos e Egr-1 em distintas regiões cerebrais. Camundongos ADULTO e ADOLESC receberam agudamente salina (SAL) ou EtOH e sua atividade locomotora foi quantificada em campo aberto (CA). Uma hora após a injeção, a expressão de c-Fos e Egr-1 foi avaliada por imuno-histoquímica. Foram constatados: aumento na atividade locomotora e na expressão de c-Fos e Egr-1 nos animais tratados com EtOH. Outros animais ADULTO e ADOLESC foram tratados com EtOH ou SAL repetidamente (15 dias). Uma semana após o pré-tratamento, todos animais receberam etanol. A atividade locomotora foi quantificada e a expressão de c-Fos e Egr-1 foi avaliada. Os ADOLESC desenvolveram tolerância, enquanto que os ADULTO apresentaram sensibilização comportamental locomotora. A administração prolongada de etanol induziu alterações adaptativas diferenciadas, dependentes da idade, na expressão de c-Fos e Egr-1 em várias regiões encefálicas. / The transition from adolescence (ADOLESC) into adulthood (ADULT) is characterized by behavioral maturation, as well as of structures and systems of CNS. This study investigated the behavioral effects of acute and repeated administration of EtOH (2,0 g/kg) in ADULT and ADOLESC mice, as well as the c-Fos and Egr-1 expression induced by EtOH in distinctive brain structures. Locomotor activity from ADULT and ADOLESC mice acutely treated with either saline (SAL) or EtOH was measured in open field (OF). One hour after injections, c-Fos and Egr-1 expressions were evaluated by immunohistochemistry. The results demonstrated increased locomotor activity and increased c-Fos and Egr-1 expression in EtOH-treated mice. Other groups of ADULT and ADOLESC mice were treated repeatedly with SAL or EtOH during 15 days. One week after this pretreatment, all animals received an injection of EtOH. The locomotor activity was quantified and c-Fos and Egr-1 expressions were evaluated. While ADULT mice presented behavioral sensitization, ADOLESC mice developed tolerance. The repeated administration of EtOH induced an age-dependent differential expression of c-Fos and Egr-1 in several brain regions.

A transição da adolescência (ADOLESC) para a idade adulta (ADULTO) é caracterizada por uma maturação de comportamentos, assim como de estruturas e sistemas do SNC. Este estudo investigou os efeitos da administração aguda e repetida de baixas doses de etanol (2,0 g/kg) em camundongos ADULTO (60 dias) e ADOLESC (28 dias), bem como a expressão de c-Fos e Egr-1 em distintas regiões cerebrais. Camundongos ADULTO e ADOLESC receberam agudamente salina (SAL) ou EtOH e sua atividade locomotora foi quantificada em campo aberto (CA). Uma hora após a injeção, a expressão de c-Fos e Egr-1 foi avaliada por imuno-histoquímica. Foram constatados: aumento na atividade locomotora e na expressão de c-Fos e Egr-1 nos animais tratados com EtOH. Outros animais ADULTO e ADOLESC foram tratados com EtOH ou SAL repetidamente (15 dias). Uma semana após o pré-tratamento, todos animais receberam etanol. A atividade locomotora foi quantificada e a expressão de c-Fos e Egr-1 foi avaliada. Os ADOLESC desenvolveram tolerância, enquanto que os ADULTO apresentaram sensibilização comportamental locomotora. A administração prolongada de etanol induziu alterações adaptativas diferenciadas, dependentes da idade, na expressão de c-Fos e Egr-1 em várias regiões encefálicas. / The transition from adolescence (ADOLESC) into adulthood (ADULT) is characterized by behavioral maturation, as well as of structures and systems of CNS. This study investigated the behavioral effects of acute and repeated administration of EtOH (2,0 g/kg) in ADULT and ADOLESC mice, as well as the c-Fos and Egr-1 expression induced by EtOH in distinctive brain structures. Locomotor activity from ADULT and ADOLESC mice acutely treated with either saline (SAL) or EtOH was measured in open field (OF). One hour after injections, c-Fos and Egr-1 expressions were evaluated by immunohistochemistry. The results demonstrated increased locomotor activity and increased c-Fos and Egr-1 expression in EtOH-treated mice. Other groups of ADULT and ADOLESC mice were treated repeatedly with SAL or EtOH during 15 days. One week after this pretreatment, all animals received an injection of EtOH. The locomotor activity was quantified and c-Fos and Egr-1 expressions were evaluated. While ADULT mice presented behavioral sensitization, ADOLESC mice developed tolerance. The repeated administration of EtOH induced an age-dependent differential expression of c-Fos and Egr-1 in several brain regions.

O presente trabalho foi subdividido em quatro capítulos com os seguintes objetivos: (i) elaborar uma minuciosa revisão de literatura abordando os principais aspectos da interação viróide-hospedeiro e as relações evolutivas dos viróides e virusóides; (ii) identificar e caracterizar viróides associados a videiras, no Brasil; (iii) purificar, clonar e caracterizar, um RNA circular de seqüência totalmente desconhecida; (iv) estudar alguns aspectos relacionados à interação viróidehospedeiro. Inicialmente, foram identificadas e caracterizadas duas espécies de viróides (o Citrus exocortis viroid CEVd e o Hop stunt viroid, HSVd) isolados de videiras no Brasil. Para tal, promoveu-se extração de RNAs totais de folhas de Vitis vinifera ‘Cabernet Sauvignon’ e V. labrusca ‘Niagara Rosada’, seguida de RT-PCR com oligonucleotídeos específicos. Os fragmentos de DNA amplificados foram clonados e seqüenciados. Os resultados revelaram que as videiras estavam duplamente infectadas com o CEVd e HSVd. As análises filogenéticas mostraram que os clones de HSVd de videira agruparam-se com outros variantes de videira, formando um grupo separado de um segundo formado por variantes de citros. Já os clones de CEVd de videira agruparam-se com isolados de citros e videira. No capítulo 3, empregou-se um método para a clonagem e caracterização de um pequeno RNA circular (com aproximadamente 300 nucleotídeos) de seqüência totalmente desconhecida. Este RNA, quando submetido à eletroforese dupla em géis de poliacrilamida desnaturantes, apresentou um retardamento na migração, similar aos viróides. Após a clonagem de fragmentos do RNA, amplificados via RTPCR com oligonucleotídeos aleatórios (apresentando seis nucleotídeos degenerados no terminal 3&#145),os clones obtidos foram seqüenciados. A partir desses dados, dois oligonucleotídeos adjacentes de polaridades opostas foram desenhados e empregados para amplificar via RT-PCR a seqüência completa do RNA circular. A análise das seqüências revelou a presença da CCR (central conserved region) do Apple scar skin viroid (ASSVd), espécie tipo do gênero Apscaviroid, e compartilha similaridade com outros membros deste gênero, o que sugere fortemente que o RNA circular é um viróide recombinante. Finalmente, no capítulo 4, foram realizados experimentos que comprovaram a existência do motivo loop E (presente na CCR de algumas espécies dos Pospiviroidae) in vivo no PSTVd. Demonstrou-se também, utilizando ensaios de união in vitro (análise de retardo em gel, EMSA e entrecruzamento com luz ultravioleta), que as proteínas L5 e TFIIIA de Arabidopsis thaliana se unem especificamente ao PSTVd com a mesma afinidade que elas se unem ao seu substrato natural, o rRNA 5S, enquanto que a afinidade por um viróide cloroplástico (Avocado sunblotch viroid, ASBVd) foi significativamente menor. Estas duas proteínas devem participar na síntese e movimento intracelular do PSTVd in vivo. / The present work has been divided into four chapters to: (i) review the main points in viroid-host interactions and present different aspects in the evolutionary relationship of the viroids and virusoids; (ii) identify and characterize viroids infecting grapevine in Brazil; (iii) purify, clone and sequence what appears to be a novel citrus viroid; (iv) study some aspects related to the viroid-host protein interactions. Firstly, two viroid species (Citrus exocortis viroid, CEVd and Hop stunt viroid, HSVd) were identified and characterized from grapevine in Brazil. Total RNAs, extracted from leaves of Vitis vinifera ‘Cabernet Sauvignon’ and V. labrusca ‘Niagara Rosada’, were RT-PCR amplified with specific primers for the five viroids described infecting grapevines. The resulting products were separated by agarose gel electrophoresis and the DNA fragments of the expected full-size were eluted, cloned and sequenced. The grapevines analyzed were doublyinfected by CEVd and HSVd. A phylogenetic analysis showed that the Brazilian grapevine HSVd variants clustered with other grapevine HSVd variants forming a specific group separated from citrus variants, whereas the Brazilian CEVd variants clustered with other citrus and grapevine variants. On the other hand, a method for cloning small circular RNAs of unknown sequence has been applied to an RNA of this kind from citrus (with ca. 300 nucleotides). This RNA, when analyzed by PAGE in denaturing conditions, showed the slow mobility typical of viroid RNAs. After denaturation, the purified RNA was RT-PCR amplified using a primer with six randomized positions at its 3? terminus, with the resulting products being then cloned and sequenced. From these data, two adjacent primers of opposite polarities were designed and used to RT-PCR amplify the complete sequence. Analysis of the sequences revealed the presence of the CCR (central conserved region) of the Apple scar skin viroid (ASSVd), the type member of the genus Apscaviroid, and scattered similarities with other members of this genus, suggesting that the circular RNA is a viroid recombinant. Finally, UV irradiation of infected tissue has revealed the existence in vivo of an RNA motif (loop E) in Potato spindle tuber viroid (PSTVd), the type member of the family Pospiviroidae (nuclear viroids), and RNA-protein binding followed by eletrophoretic mobility shift (EMSA) and UV cross-linking label transfer assays have shown that transcription factor IIIA (TFIIIA) and L5 ribosomal protein from Arabidopsis thaliana bind this RNA in vitro with the same affinity as they bind 5S rRNA, whereas the affinity for a chloroplastic viroid (Avocado sunblotch viroid, ASBVd) is significantly lower. These two proteins may participate in synthesis and delivery of PSTVd in vivo.

O presente trabalho foi subdividido em quatro capítulos com os seguintes objetivos: (i) elaborar uma minuciosa revisão de literatura abordando os principais aspectos da interação viróide-hospedeiro e as relações evolutivas dos viróides e virusóides; (ii) identificar e caracterizar viróides associados a videiras, no Brasil; (iii) purificar, clonar e caracterizar, um RNA circular de seqüência totalmente desconhecida; (iv) estudar alguns aspectos relacionados à interação viróidehospedeiro. Inicialmente, foram identificadas e caracterizadas duas espécies de viróides (o Citrus exocortis viroid CEVd e o Hop stunt viroid, HSVd) isolados de videiras no Brasil. Para tal, promoveu-se extração de RNAs totais de folhas de Vitis vinifera ‘Cabernet Sauvignon’ e V. labrusca ‘Niagara Rosada’, seguida de RT-PCR com oligonucleotídeos específicos. Os fragmentos de DNA amplificados foram clonados e seqüenciados. Os resultados revelaram que as videiras estavam duplamente infectadas com o CEVd e HSVd. As análises filogenéticas mostraram que os clones de HSVd de videira agruparam-se com outros variantes de videira, formando um grupo separado de um segundo formado por variantes de citros. Já os clones de CEVd de videira agruparam-se com isolados de citros e videira. No capítulo 3, empregou-se um método para a clonagem e caracterização de um pequeno RNA circular (com aproximadamente 300 nucleotídeos) de seqüência totalmente desconhecida. Este RNA, quando submetido à eletroforese dupla em géis de poliacrilamida desnaturantes, apresentou um retardamento na migração, similar aos viróides. Após a clonagem de fragmentos do RNA, amplificados via RTPCR com oligonucleotídeos aleatórios (apresentando seis nucleotídeos degenerados no terminal 3&#145),os clones obtidos foram seqüenciados. A partir desses dados, dois oligonucleotídeos adjacentes de polaridades opostas foram desenhados e empregados para amplificar via RT-PCR a seqüência completa do RNA circular. A análise das seqüências revelou a presença da CCR (central conserved region) do Apple scar skin viroid (ASSVd), espécie tipo do gênero Apscaviroid, e compartilha similaridade com outros membros deste gênero, o que sugere fortemente que o RNA circular é um viróide recombinante. Finalmente, no capítulo 4, foram realizados experimentos que comprovaram a existência do motivo loop E (presente na CCR de algumas espécies dos Pospiviroidae) in vivo no PSTVd. Demonstrou-se também, utilizando ensaios de união in vitro (análise de retardo em gel, EMSA e entrecruzamento com luz ultravioleta), que as proteínas L5 e TFIIIA de Arabidopsis thaliana se unem especificamente ao PSTVd com a mesma afinidade que elas se unem ao seu substrato natural, o rRNA 5S, enquanto que a afinidade por um viróide cloroplástico (Avocado sunblotch viroid, ASBVd) foi significativamente menor. Estas duas proteínas devem participar na síntese e movimento intracelular do PSTVd in vivo. / The present work has been divided into four chapters to: (i) review the main points in viroid-host interactions and present different aspects in the evolutionary relationship of the viroids and virusoids; (ii) identify and characterize viroids infecting grapevine in Brazil; (iii) purify, clone and sequence what appears to be a novel citrus viroid; (iv) study some aspects related to the viroid-host protein interactions. Firstly, two viroid species (Citrus exocortis viroid, CEVd and Hop stunt viroid, HSVd) were identified and characterized from grapevine in Brazil. Total RNAs, extracted from leaves of Vitis vinifera ‘Cabernet Sauvignon’ and V. labrusca ‘Niagara Rosada’, were RT-PCR amplified with specific primers for the five viroids described infecting grapevines. The resulting products were separated by agarose gel electrophoresis and the DNA fragments of the expected full-size were eluted, cloned and sequenced. The grapevines analyzed were doublyinfected by CEVd and HSVd. A phylogenetic analysis showed that the Brazilian grapevine HSVd variants clustered with other grapevine HSVd variants forming a specific group separated from citrus variants, whereas the Brazilian CEVd variants clustered with other citrus and grapevine variants. On the other hand, a method for cloning small circular RNAs of unknown sequence has been applied to an RNA of this kind from citrus (with ca. 300 nucleotides). This RNA, when analyzed by PAGE in denaturing conditions, showed the slow mobility typical of viroid RNAs. After denaturation, the purified RNA was RT-PCR amplified using a primer with six randomized positions at its 3? terminus, with the resulting products being then cloned and sequenced. From these data, two adjacent primers of opposite polarities were designed and used to RT-PCR amplify the complete sequence. Analysis of the sequences revealed the presence of the CCR (central conserved region) of the Apple scar skin viroid (ASSVd), the type member of the genus Apscaviroid, and scattered similarities with other members of this genus, suggesting that the circular RNA is a viroid recombinant. Finally, UV irradiation of infected tissue has revealed the existence in vivo of an RNA motif (loop E) in Potato spindle tuber viroid (PSTVd), the type member of the family Pospiviroidae (nuclear viroids), and RNA-protein binding followed by eletrophoretic mobility shift (EMSA) and UV cross-linking label transfer assays have shown that transcription factor IIIA (TFIIIA) and L5 ribosomal protein from Arabidopsis thaliana bind this RNA in vitro with the same affinity as they bind 5S rRNA, whereas the affinity for a chloroplastic viroid (Avocado sunblotch viroid, ASBVd) is significantly lower. These two proteins may participate in synthesis and delivery of PSTVd in vivo.