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Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa René Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil / A emergência de espécies de Leishmania resistentes ao antimonial é um grave problema em vários países. A quimioterapia é a medida mais importante para o controle das leishmanioses, visto que não existe ainda uma vacina eficiente para uso em humanos. Além disso, o controle vetorial é difícil em razão das características ambientais muito diversas e da existência de um grande número de reservatórios domésticos e silvestres dificulta também o controle. Os antimoniais pentavalentes, SbV, são os medicamentos de primeira escolha no tratamento de todas as formas de leishmaniose em vários países. Apesar de serem amplamente utilizados na quimioterapia das leishmanioses por mais de setenta anos, apresentam alta toxicidade no tratamento clínico. Também, alguns pacientes são resistentes ao tratamento clínico com esses
compostos. Neste trabalho, realizou-se uma análise proteômica comparativa entre linhagens de L. braziliensis e L. infantum sensíveis e resistentes ao SbIII mediante a utilização da metodologia 2-DE, seguida por espectrometria de massas (LC/MS/MS). Nesta tese utiliza-se a nomenclatura L. infantum (syn. L. chagasi). A análise comparativa dos perfis proteômicos entre as linhagens de Leishmania analisadas revelou que 192 spots foram únicos e/ou mais abundantes. Dos 132 spots proteicos submetidos à análise por MS, 80 foram identificados correspondendo a 57 proteínas distintas. A análise comparativa dos dados mostrou que a maioria das proteínas com abundância diferencial em ambas as espécies está envolvida na defesa antioxidante, na resposta geral ao estresse, no metabolismo de glicose e de aminoácidos e na organização do citoesqueleto. Cinco proteínas foram mais abundantes em ambas as linhagens de Leishmania resistentes ao SbIII: triparedoxina peroxidase, alfa-tubulina, HSP83, HSP70 e HSP60.
Os ensaios de Western blotting 1-DE e 2-DE confirmaram os dados da análise proteômica. Estes ensaios revelaram que a ciclofilina-A é menos expressa em ambas as linhagens resistentes, LbSbR e LcSbR. De outro lado, a pteridina redutase é mais expressa na linhagem resistente LbSbR e apresenta nível de expressão similar entre as linhagens sensíveis e resistentes de L. infantum. A triparedoxina peroxidase é mais abundante em ambas as linhagens resistentes, LbSbR e LcSbR.
Estes resultados sugerem que o aumento da expressão de enzimas da defesa antioxidante pode desempenhar papel significativo na resistência dos parasitos aos antimoniais. Em conjunto, os dados mostram que o mecanismo de resistência de Leishmania spp. ao antimônio é complexo e multifatorial. É importante ressaltar que entre as 57 proteínas identificadas como diferencialmente adundantes entre as linhagens de Leishmania spp. sensíveis e resistentes ao antimonial 17 foram identificadas anteriormente por outros autores e que as outras 40 foram observadas apenas em nossa análise proteômica de linhagens de Leishmania spp. Resistentes ao SbIII.
Acreditamos que algumas dessas proteínas estejam associadas com a resposta geral ao estresse e que outras podem estar associadas ao mecanismo de resistência ao antimônio em Leishmania spp. Neste contexto, a futura análise funcional será muito importante para determinar a possível associação destas proteínas com o fenótipo de resistência de Leishmania aos antimoniais. / The emergence of drug-resistant Leishmania species is a significant problem in several countries. Chemotherapy is the most important alternative for controlling leishmaniases, since there is no effective vaccine for using in humans. Furthermore, the vector control is difficult due to different environmental characteristics and the existence of a large number of domestic and wild reservoirs. Pentavalent antimonials, Sb V, are the first-choice drugs in the treatment of all forms of leishmaniases in several Countries. Although they are widely used in the chemotherapy of leishmaniases for more than 60 years, they have high toxicity and some patients are resistant to clinical treatment with these compounds. In this study, we carried out a comparative proteomic analysis of antimony-susceptible and antimony-resistant Leishmania braziliensis (LbSbR) and Leishmania infantum (syn. L. chagasi) (LcSbR) lines using twodimensional gel electrophoresis (2-DE) followed by mass spectrometry (LC/MS/MS) for protein identification. Comparative analysis of proteomic profiles between the Leishmania lines analyzed showed that 192 spots were unique and/or most abundant. Out of 132 protein spots submitted to MS, we identified 80 that corresponded to 57 distinct proteins.
Comparative analysis showed that most of the protein spots with differential abundance in both species are involved in antioxidant defense, general stress response, glucose and amino acid metabolism, and cytoskeleton organization. Five proteins were more abundant in both SbIII-resistant Leishmania lines: tryparedoxin peroxidase, alpha-tubulin, HSP83, HSP70, and HSP60. Analysis of protein abundance by Western blotting assays 1-DE e 2-DE confirmed our proteomic data. These assays revealed that cyclophilin-A is less expressed in both LbSbR and LcSbR lines. On the other hand, the expression of pteridine reductase is higher in the LbSbR line, and it has similar expression level between SbIII-susceptible and -resistant L. infantum lines. The tryparedoxin peroxidase is overexpressed in both LbSbR and LcSbR lines.
These results suggest that an increased in expression of anti-oxidant defense enzymes may play a significant role in the antimonial resistance in these parasites. Together, these results showed that the mechanism of antimony-resistance in Leishmania spp. is complex and multifactorial. Interestingly, among the 17out of 57 proteins identified as differentially abundant between SbIII-susceptible and -resistant lines, were also previously identified by others authors and the other 40 proteins were observed only in our proteomic analysis of SbIII-resistant Leishmania spp. lines. We believe that some of them are associated with the general stress response and others may be associated with the mechanism of resistance of Leishmania spp. to antimony. In this context, functional analysis will be very important to determine a possible association of these proteins with the antimony-resistance phenotype in Leishmania.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.arca.fiocruz.br:icict/10029 |
| Date | January 2013 |
| Creators | Matrangolo, Fabiana da Silva Vieira |
| Contributors | Murta, Silvane Maria Fonseca, Babá, Elio, Sá, Renata Guerra, Cuervo, Patrícia, Nahum, Laila Alves, Soares, Rodrigo Pedro Pinto, Murta, Silvane Maria Fonseca |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da FIOCRUZ, instname:Fundação Oswaldo Cruz, instacron:FIOCRUZ |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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