Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-07T14:28:24Z No. of bitstreams: 1 Tese_BCM_CarolinaPauladeSouzaMoreira.pdf: 2546138 bytes, checksum: 434d23f2a06b0ab5b462d8c8c67dafe8 (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-07T14:28:39Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese_BCM_CarolinaPauladeSouzaMoreira.pdf: 2546138 bytes, checksum: 434d23f2a06b0ab5b462d8c8c67dafe8 (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-07T18:25:45Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese_BCM_CarolinaPauladeSouzaMoreira.pdf: 2546138 bytes, checksum: 434d23f2a06b0ab5b462d8c8c67dafe8 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-07T18:25:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_BCM_CarolinaPauladeSouzaMoreira.pdf: 2546138 bytes, checksum: 434d23f2a06b0ab5b462d8c8c67dafe8 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa René Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil / Existe uma necessidade urgente de drogas leishmanicidas mais eficazes e/ou menos tóxicas para contribuir com o arsenal terapêutico atualmente disponível. O grupo de pesquisa de Química de Produtos Naturais Bioativos do Laboratório de Química de Produtos Naturais bioativos do CPqRR tem realizado projetos de bioprospecção de flora brasileira buscando por novos hits que possam ser utilzados no tratamento das leishmanioses. A espécie Baccharis platypoda (Asteraceae) foi uma espécie que mostrou atividade leishmanicida e que foi pouco investigada do ponto de vista químico e biológico. O estudo químico biomonitorado do extrato etanólico das folhas dessa espécie levou à obtenção de cinco frações com elevada toxicidade para formas amastigotas intracelulares de L. (L.) amazonensis e o fracionamento de uma dessas frações resultou no isolamento de um novo diterpeno clerodano, de baixa atividade, que após análise de RMN e ESI-TOF-MS/MS foi denominado platypodiol ou 1R,3R,4R,8aR)-3-(hidroximetil)-4-[(3E)-5-hidroxi-3-metilpent-3-en-1-il]-4,8,8a-trimetil-1,2,3,4,4a,5,6,8a-octahidronaftalen-1-ol. Em estágio sanduíche realizado na Universidade de Granada – Espanha os compostos fenólicos do extrato etanólico das folhasd de B. platypoda foram investigados por HPLC–ESI-Q-TOF-MS/MS no modo negativo e 19 ácidos fenólicos, 10 flavonas, 5 flavonóis e 6 flavanonas foram identificados. Além disso, o potencial antioxidante do extrato foi avaliado em quatro ensaios, mostrando o potencial antioxidante da espécie. Esses resultados aumentaram o conhecimento fitoquímico sobre a espécie brasileira B. platypoda, considerando que ela foi até o momento pouco investigada cientificamente / There is an urgent need for effective leishmanicida drugs to replace or supplement those in current use. Our group have been bioprospecting many Brazilian plants looking for potential new ‘hits’ to combat leishmaniasis. We found that Baccharis platypoda was one of the Asteraceae species that displayed leishmanicidal activity and it was few investigated. The bioassay-guided chemical study of the ethanolic extract of the leaves resulted in five fractions with high toxicity for intracellular amastigotes of L. (L.) amazonensis and the fractionation of one of these fractions led to a new diterpene clerodane with low activity that was named platypodiol or 1R,3R,4R,8aR)-3-(hidroxymethyl)-4-[(3E)-5-hydroxy-3-methylpent-3-en-1-yl]-4,8,8a-trimethyl-1,2,3,4,4a,5,6,8a-octahydronaftalen-1-ol upon NMR and ESI-TOF-MS/ MS analysis. We investigated in Granada University - Spain the phenolic components of the ethanolic leaf extract using HPLC–ESI-Q-TOF-MS/MS in negative mode and provided the identification of 19 phenolic acids, 10 flavones, 5 flavonols and 6 flavanones. We also determined the antioxidant capacity of the extract. Considering the few publications about this species, this result has increased the phytochemical knowledge about B. platypoda.

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2013-08-07T13:30:22Z No. of bitstreams: 1 Tese_MarceleNevesRocha.pdf: 3850783 bytes, checksum: e18bb3542328e15691057c221725ec86 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-08-07T13:30:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_MarceleNevesRocha.pdf: 3850783 bytes, checksum: e18bb3542328e15691057c221725ec86 (MD5) Previous issue date: 2013 / As Leishmanioses são doenças negligenciadas. O tratamento dos pacientes é a principal medida de controle, porém a quimioterapia das Leishmanioses apresenta dificuldades incluindo: toxicidade dos medicamentos disponíveis, via de administração parenteral e resistência natural de algumas cepas. O método de teste de drogas clássico in vitro baseado na contagem microscópica de macrófagos infectados apresenta limitações por ser laborioso, não automatizado e sujeito a variações do observador. Deste modo, a busca por novos métodos de triagem de drogas faz-se necessário. O estabelecimento de métodos semi-automatizados contribuiria para aumentar a eficiência da busca de novas drogas contra Leishmania. Neste trabalho, a cepa de Leishmania amazonensis (PH8) foi transfectada com a proteína vermelha fluorescente (RFP). Os parasitos transfectados foram avaliados segundo parâmetros celulares e de susceptibilidade aos fármacos leishmanicidas tradicionais e derivados do propranolol. Os parasitos selvagens (WT) e transfectados (RFP) foram analisados pela Citometria de Fluxo e Microscopia de Fluorescência sendo facilmente discriminados por estas técnicas. Em geral, não foram observadas diferenças na susceptibilidade entre as cepas WT e RFP frente às moléculas testadas. Os parasitos RFPs foram submetidos ao teste de drogas com posterior leitura no fluorímetro para a padronização do método fluorimétrico. O método fluorimétrico se mostrou bastante reprodutível em relação ao método clássico. Entretanto, durante a padronização do método, mudanças na concentração das drogas foram necessárias bem como a determinação de um ponto de corte nos valores de IC50. Este trabalho também avaliou a atividade leishmanicida dos derivados das poliaminas e complexos metálicos de lapachol utilizando-se o método clássico. Não só os derivados do propranolol, mas também os das poliaminas e lapachol se mostraram tóxicos paracélulas de Hepatoma humano (HepG2). Este trabalho possibilitou pela primeira vez a utilização de parasitos RFPs como modelo de um teste de drogas semi-automatizado. / The leishmaniasis are neglected diseases. Patient treatment is the main control measure, however leishmanisasis chemotherapy faces several problems including: drug toxicity, the administration rout and natural drug resistance. Also, the classical in vitro drug testing method, which is based on microscopically counting the number of infected macrophages is rather limited, laborious cannot be automated and is subjected to variations due to observer. For this reason, the search for new methods and establishment of semi-automated methos id necessary to improve the efficiency of new drugs discovery. In this present work, Leishmania amazonensis strain PH8 was transfected with the red fluorescent protein (RFP). Transfected parasites were evaluated for their cellular parameters and susceptibility against traditional drugs and novel propranolol derivates. Wild type (WT) and transfected (RFP) parasites were analyzed by flow citometry and fluorescent microscopy. Overall we did not observe any difference in drug susceptibility between WT and RFP parasites. RFP parasite were then submitted drug susceptibility test and analyzed by fluorimeter. The fluorimetric method showed a comparable reproducibility to the standard method. However, during experimentation, some adjustments on drug concentrations were necessary to determine IC50 threshold values. Additionally, in this work, weevaluated the activity of polyamine derivates and (metalic lapachol complexes) against leishmania by the classical method. Propranolol derivates, polymaine and metalic lapachol complexes were shown to be citotoxic as shown by HepG2 cell cultures. This work was the first to show the use of RFP parasites as a model for drug screening in a semi-automated method.

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2013-12-13T18:17:24Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Douglas de Souza Moreira.pdf: 7794967 bytes, checksum: 2d88472031668d7a41792b1f3ad4546e (MD5) / Made available in DSpace on 2013-12-13T18:17:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação Douglas de Souza Moreira.pdf: 7794967 bytes, checksum: 2d88472031668d7a41792b1f3ad4546e (MD5) Previous issue date: 2012 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas René Rachou / Transportadores ABC (ATP-binding cassette) abrangem proteínas transmembrana, que utilizam a energia resultante da hidrólise de ATP, para transportar uma variedade de moléculas através de membranas biológicas, incluindo drogas quimioterapêuticas. Alguns membros dessa superfamília ABC estão associados com quimioresistência através da superexpressão de proteínas de resistência a múltiplas drogas (multidrug resistance associated protein – MRP). Uma dessas proteínas é a Pgp (P-glicoproteína), que está relacionada à resistência através da extrusão de compostos tóxicos da célula. O gene MRPA, um transportador da subfamília ABCC, está envolvido na resistência pelo sequestro do conjugado metal-tiol em vesículas próximas da bolsa flagelar da Leishmania. Neste estudo, formas promastigotas de populações sensíveis e resistentes ao antimonial trivalente (SbIII) de quatro espécies de Leishmania, L. (V.) guyanensis, L. (L.) amazonensis, L. (V.) braziliensise L. (L.) infantum chagasi, foram analisadas quanto: a localização cromossômica, presença de amplificação extracromossomal e análise da amplificação do gene MRPA; níveis de mRNA dos genes MRPA e MRP; expressão da proteína Pgp e determinação do nível intracelular de SbIII. Ensaios de PFGE indicaram a associação de amplificação cromossomal e extracromossomal do gene MRPA com o fenótipo de resistência à droga nas espécies de Leishmania estudadas. Os resultados obtidos através dee lise alcalina dos parasitos mostraram a presença de amplificação extracromossomal apenas na amostra resistente de L. (V.) braziliensis. Análises de Southern blot com as endonucleases BamHI e HindIII indicaram a presença de polimorfismos na sequência do gene MRPA em algumas amostras de Leishmania analisadas. Adicionalmente, foi observada amplificação desse gene nas populações de Leishmania resistentes ao SbIII. Ensaios de PCR quantitativo em tempo real mostraram aumento dos níveis de mRNA do gene MRPA nas populações resistentes de L. (L.) amazonensis e L. (V.) braziliensis, comparado com seus respectivos pares sensíveis. Os níveis de mRNA do gene MRP estão aumentados em todas as populações de Leishmania resistentes ao SbIII analisadas neste estudo. Os resultados de Western blot revelaram que a proteína Pgp está mais expressa nas populações resistentes de L. (V.) guyanensis eL. (L.) amazonensis. Os dados obtidos de quantificação dos níveis intracellulares de SbIII por espectrometria de absorção atômica em forno de grafite mostraram uma redução no acúmulo de SbIII, nas populações resistentes de L. (V.) guyanensis,L. (L.) amazonensise L. (V.) braziliensis, quando comparadas às respectivas populações sensíveis. Nossos resultados indicam que os mecanismos de resistência ao antimônio são diferentes entre as espécies de Leishmania analisadas. / ATP-binding cassette (ABC) transporters comprise transmembrane proteins that use energy from ATP hydrolysis to transport a variety of molecules across biological membranes, including chemotherapeutic drugs. Some members of this ABC superfamily are associated with chemoresistance by overexpression of multidrug resistance associated proteins (MRP). One of these proteins is the Pgp (P-glycoprotein), which is associated with resistance by extruding toxic compounds outside the cell. The MRPA gene, a transporter of ABCC subfamily, is involved in the resistance by sequestering metal-thiol conjugate in vesicles close to the flagellar pocket of Leishmaniaparasite. In this study, promastigote forms of susceptible and trivalent antimony (SbIII)-resistant populations of four Leishmaniaspecies, L. (V.) guyanensis, L. (L.) amazonensis, L. (V.) braziliensis and L. (L.) infantum chagasi, were analyzed for: chromosomal location, presence of extrachromosomal amplification and analysis of amplification of the MRPA gene; the mRNA levels of MRPA and MRP genes; Pgp protein expression and determination of intracellular SbIII level. PFGE analysis indicated the association of chromosomal and extrachromosomal amplification ofMRPA gene with SbIII-resistance phenotype in Leishmania species studied. The results obtained by alkaline lysis of these Leishmanias amples showed the presence of extrachromosomal amplification only in the SbIII-resistant L. (V.) braziliensis population. Southern blot analysis with the endonucleases BamHI and HindIII indicated the presence of polymorphisms in the sequence of MRPA gene in some Leishmania samples analyzed. Additionally, we observed amplification of thisgene in all SbIII-resistant Leishmania populations analyzed. Real-time quantitative RT-PCR assays showed increased levels of mRNA MRPA gene in SbIII-resistant populations of L. (L.) amazonensis and L. (V.) braziliensis compared to their respective susceptible counterparts. The levels of mRNA MRP gene are increased in all SbIII-resistant Leishmania populations analyzed in this study. Western blot analysis revealed that Pgp protein is more expressed in SbIII-resistant L. (V.) guyanensisand L. (L.) amazonensispopulations. The intracellular level of SbIII quantified by graphite furnace atomic absorption spectrometry showed a reduction in the accumulation of Sb in SbIII-resistant L. (V.) guyanensis, L. (L.) amazonensisand L. (V.) braziliensis populations when compared to their respective susceptible populations. Our results indicate that the mechanisms of antimony-resistance are different between species of Leishmania analyzed.

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-16T16:07:48Z No. of bitstreams: 1 Tese_BCM_FabianadaSilvaVieiraMatrangolo.pdf: 1842322 bytes, checksum: 73bd382ffd0cc26f8f984240d3143696 (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-16T16:07:57Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese_BCM_FabianadaSilvaVieiraMatrangolo.pdf: 1842322 bytes, checksum: 73bd382ffd0cc26f8f984240d3143696 (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-16T16:08:06Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese_BCM_FabianadaSilvaVieiraMatrangolo.pdf: 1842322 bytes, checksum: 73bd382ffd0cc26f8f984240d3143696 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-16T16:08:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_BCM_FabianadaSilvaVieiraMatrangolo.pdf: 1842322 bytes, checksum: 73bd382ffd0cc26f8f984240d3143696 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa René Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil / A emergência de espécies de Leishmania resistentes ao antimonial é um grave problema em vários países. A quimioterapia é a medida mais importante para o controle das leishmanioses, visto que não existe ainda uma vacina eficiente para uso em humanos. Além disso, o controle vetorial é difícil em razão das características ambientais muito diversas e da existência de um grande número de reservatórios domésticos e silvestres dificulta também o controle. Os antimoniais pentavalentes, SbV, são os medicamentos de primeira escolha no tratamento de todas as formas de leishmaniose em vários países. Apesar de serem amplamente utilizados na quimioterapia das leishmanioses por mais de setenta anos, apresentam alta toxicidade no tratamento clínico. Também, alguns pacientes são resistentes ao tratamento clínico com esses compostos. Neste trabalho, realizou-se uma análise proteômica comparativa entre linhagens de L. braziliensis e L. infantum sensíveis e resistentes ao SbIII mediante a utilização da metodologia 2-DE, seguida por espectrometria de massas (LC/MS/MS). Nesta tese utiliza-se a nomenclatura L. infantum (syn. L. chagasi). A análise comparativa dos perfis proteômicos entre as linhagens de Leishmania analisadas revelou que 192 spots foram únicos e/ou mais abundantes. Dos 132 spots proteicos submetidos à análise por MS, 80 foram identificados correspondendo a 57 proteínas distintas. A análise comparativa dos dados mostrou que a maioria das proteínas com abundância diferencial em ambas as espécies está envolvida na defesa antioxidante, na resposta geral ao estresse, no metabolismo de glicose e de aminoácidos e na organização do citoesqueleto. Cinco proteínas foram mais abundantes em ambas as linhagens de Leishmania resistentes ao SbIII: triparedoxina peroxidase, alfa-tubulina, HSP83, HSP70 e HSP60. Os ensaios de Western blotting 1-DE e 2-DE confirmaram os dados da análise proteômica. Estes ensaios revelaram que a ciclofilina-A é menos expressa em ambas as linhagens resistentes, LbSbR e LcSbR. De outro lado, a pteridina redutase é mais expressa na linhagem resistente LbSbR e apresenta nível de expressão similar entre as linhagens sensíveis e resistentes de L. infantum. A triparedoxina peroxidase é mais abundante em ambas as linhagens resistentes, LbSbR e LcSbR. Estes resultados sugerem que o aumento da expressão de enzimas da defesa antioxidante pode desempenhar papel significativo na resistência dos parasitos aos antimoniais. Em conjunto, os dados mostram que o mecanismo de resistência de Leishmania spp. ao antimônio é complexo e multifatorial. É importante ressaltar que entre as 57 proteínas identificadas como diferencialmente adundantes entre as linhagens de Leishmania spp. sensíveis e resistentes ao antimonial 17 foram identificadas anteriormente por outros autores e que as outras 40 foram observadas apenas em nossa análise proteômica de linhagens de Leishmania spp. Resistentes ao SbIII. Acreditamos que algumas dessas proteínas estejam associadas com a resposta geral ao estresse e que outras podem estar associadas ao mecanismo de resistência ao antimônio em Leishmania spp. Neste contexto, a futura análise funcional será muito importante para determinar a possível associação destas proteínas com o fenótipo de resistência de Leishmania aos antimoniais. / The emergence of drug-resistant Leishmania species is a significant problem in several countries. Chemotherapy is the most important alternative for controlling leishmaniases, since there is no effective vaccine for using in humans. Furthermore, the vector control is difficult due to different environmental characteristics and the existence of a large number of domestic and wild reservoirs. Pentavalent antimonials, Sb V, are the first-choice drugs in the treatment of all forms of leishmaniases in several Countries. Although they are widely used in the chemotherapy of leishmaniases for more than 60 years, they have high toxicity and some patients are resistant to clinical treatment with these compounds. In this study, we carried out a comparative proteomic analysis of antimony-susceptible and antimony-resistant Leishmania braziliensis (LbSbR) and Leishmania infantum (syn. L. chagasi) (LcSbR) lines using twodimensional gel electrophoresis (2-DE) followed by mass spectrometry (LC/MS/MS) for protein identification. Comparative analysis of proteomic profiles between the Leishmania lines analyzed showed that 192 spots were unique and/or most abundant. Out of 132 protein spots submitted to MS, we identified 80 that corresponded to 57 distinct proteins. Comparative analysis showed that most of the protein spots with differential abundance in both species are involved in antioxidant defense, general stress response, glucose and amino acid metabolism, and cytoskeleton organization. Five proteins were more abundant in both SbIII-resistant Leishmania lines: tryparedoxin peroxidase, alpha-tubulin, HSP83, HSP70, and HSP60. Analysis of protein abundance by Western blotting assays 1-DE e 2-DE confirmed our proteomic data. These assays revealed that cyclophilin-A is less expressed in both LbSbR and LcSbR lines. On the other hand, the expression of pteridine reductase is higher in the LbSbR line, and it has similar expression level between SbIII-susceptible and -resistant L. infantum lines. The tryparedoxin peroxidase is overexpressed in both LbSbR and LcSbR lines. These results suggest that an increased in expression of anti-oxidant defense enzymes may play a significant role in the antimonial resistance in these parasites. Together, these results showed that the mechanism of antimony-resistance in Leishmania spp. is complex and multifactorial. Interestingly, among the 17out of 57 proteins identified as differentially abundant between SbIII-susceptible and -resistant lines, were also previously identified by others authors and the other 40 proteins were observed only in our proteomic analysis of SbIII-resistant Leishmania spp. lines. We believe that some of them are associated with the general stress response and others may be associated with the mechanism of resistance of Leishmania spp. to antimony. In this context, functional analysis will be very important to determine a possible association of these proteins with the antimony-resistance phenotype in Leishmania.

Made available in DSpace on 2015-05-19T13:30:29Z (GMT). No. of bitstreams: 2 401.pdf: 9920494 bytes, checksum: 8583b102e7c583547584adc8d2fe879e (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2012 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil / O tratamento utilizado para a leishmaniose apresenta efeitos colaterais graves, exige acompanhamento médico e prolongado tempo de terapia. Assim, a prospecção de novos compostos contra esta doença ainda se faz necessária. As macroalgas possuem grande variedade de moléculas bioativas. No presente trabalho foi avaliada a atividade leishmanicida, a citotoxicidade, a produção de óxido nítrico (NO) e os possíveis alvos dos extratos de macroalgas. Foi avaliado o efeito de 10 extratos sobre o crescimento de formas promastigotas de L. amazonensis. A citotoxicidade em células de mamíferos foi avaliada através do método do MTT e o índice de seletividade foi determinado. A produção de NO por macrófagos foi avaliada pelo reagente de Griess. A análise ultraestrutural foi realizada por microscopia eletrônica. Para análise dos efeitos dos extratos sobre a membrana e o potencial de membrana mitocondrial células tratadas e controles foram submetidas à marcação com iodeto de propídio (IP) e rodamina 123. Os dados mostraram que todos os extratos inibiram o crescimento de formas promastigotas e apresentaram baixa toxidade para células de mamífero. Canistrocarpus cervicornis (CC), Dictyota mertensii (DM) e Laurencia dendroidea (LD) foram as mais efetivas e mais seletivas contra formas promastigotas entre todas as algas testadas. Estes extratos também inibiram a infecção e índice de sobrevivência de formas amastigotas no interior de macrófagos. Esses extratos aumentaram a produção de NO em relação às células controles. Alterações compatíveis com a perda de viabilidade e morte celular foram observadas por microscopia eletrônica. Células tratadas apresentaram discreto aumento no número de células IP+. Os extratos induziram alterações significativas no potencial de membrana mitocondrial. A baixa toxicidade às células de mamíferos e a atividade leishmanicida apresentadas apontam para a utilização dos extratos de CC, DM e LD como agentes promissores para o tratamento da leishmaniose cutânea

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-06-19T12:51:52Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao_Juvana Moreira Andrade.pdf: 5431599 bytes, checksum: 3d184133a348c819e04d8bdb3554b856 (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-06-19T12:52:12Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertacao_Juvana Moreira Andrade.pdf: 5431599 bytes, checksum: 3d184133a348c819e04d8bdb3554b856 (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-06-19T12:52:24Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertacao_Juvana Moreira Andrade.pdf: 5431599 bytes, checksum: 3d184133a348c819e04d8bdb3554b856 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-06-19T12:52:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao_Juvana Moreira Andrade.pdf: 5431599 bytes, checksum: 3d184133a348c819e04d8bdb3554b856 (MD5) Previous issue date: 2012 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa René Rachou / Triparedoxina peroxidase (TxP) é uma enzima que pertence à família das. peroxiredoxinas e participa da defesa antioxidante,por metabolizar peróxido de hidrogênio em moléculas de água. Dados da literatura têm mostrado que parasitos resistentes à droga podem aumentar os níveis de TxPjunto com outras enzimas, protegendo-os contra o estresse oxidativo. Inicialmente neste trabalho, avaliamos os níveis de mRNA do gene TxP e a expressão da enzima Triparedoxina peroxidase em populações de L. amazonensis, L. braziliensis,L. infantum chagasi e L. guyanensis. sensíveis e resistentes ao antimonial trivalente (SbIII). Estas populações apresentam resistência à concentração de SbIII de 4 a 20 vezes maior comparada aos seus respectivos pares sensíveis. O nível de mRNA do gene TxP, determinado por northern blot e RT-PCR quantitativo em tempo real, foi maior nas populações resistentes de L. amazonensis e L. braziliensis, enquanto que o Northern blotting mostrou maior. expressão do gene TxP na população resistente de L. guyanensis. Por outro lado, nenhuma diferença foi observada no nível do mRNA do gene TxP nas populações sensíveis e resistentes de L. infantum chagasi. Análises de southern blot mostraram que o gene cTxP não está amplificado no genoma das populações resistentes de Leishmania spp. analisadas. A expressão proteica foi determinada por ensaios de Western blotting. utilizando anticorpo policlonal contra a proteína recombinante TxP de T. cruzi. Análises do alinhamento de aminoácido da proteína TxP de T. cruzi e Leishmania spp. mostraram um alto grau de identidade entre estas sequências. O anticorpo anti-TcTxP reconheceu um polipeptídio de 25 kDa em todas as populações de Leishmania spp. analisadas.. Análises de densitometria mostraram que a proteína cTxP está 2 a 4 vezes mais expressa em todas as populações resistentes de Leishmania spp. analisadas. Na segunda parte deste estudo, ensaios funcionais da TxP foram realizados para determinar se a superexpressão da LbTxP nas populações sensíveis e resistentes de L. braziliensis. e L. infantum chagasi iria alterar o fenótipo de resistência dos parasitos transfectados ao antimonial SbIII. Análises por Western blotting mostraram que o nível de expressão da proteína TxP foi de 2 a 4 vezes maior nos parasitos transfectados quando comparado aos parasitos não-transfectados. Análises de IC50 destes parasitos mostraram que a. superexpressão do gene TxP na população de L. braziliensis sensível aumentou 2 vezes a resistência ao SbIII, quando comparado à população parental. Por outro lado, a superexpressão de TxP na população resistente de L. braziliensis reverteu o fenótipo de resistência. Os parasitos antes resistentes, após atransfecção se tornaram muito sensíveis ao SbIII. Além disto, a superexpressão daTxP em populações sensíveis e resistentes de L. infantum chagasinão alterou o fenótipo de resistência ao SbIII.. Concluindo, nossos resultados de análise funcional mostraram que a enzima triparedoxina peroxidase está envolvida no fenótipode resistência de L. braziliensis ao antimonial. / Tryparedoxin peroxidase (TxP) is an enzyme that belongs to family of peroxiredoxins and participates in the antioxidant defense by metabolizing hydrogen peroxide in water molecules. Literature data have reported that drug-resistant parasites may increase the levels of TxP along with other enzymes, protecting them against oxidative stress. Initially in this study, we analyzed the TxP mRNA levels and protein expression levels in populations of L. amazonensis, L. braziliensis, L. infantum chagasi and L. guyanensis susceptible and resistant to SbIII. These populations exhibit index of resistance to SbIII 4 to 20-fold higher compared to their respective counterparts susceptible. The level of cTxP mRNA determined by northern blot and quantitative real time RT-PCR was higher in the L. amazonensis and L. braziliensis resistant populations while that Northern blot showed increased expression this gene in the L. guyanensis resistant population. Moreover, no difference was observed in the level of cTxP mRNA between susceptible and resistant L. infantum chagasi populations. Southern blot analyzes showed that the TxP gene is not amplified in the genome of SbIII-resistant Leishmania spp. populations analyzed. Analysis of protein expression was determined by Western blotting assays using polyclonal antibody against the TxP recombinant protein from T. cruzi. Amino acid alignment of TxP sequence of T. cruzi and Leishmania spp. showed a high degree of identity among these sequences. The anti-TcTxP antibody recognized a 25 kDa polypeptide in all Leishmania spp. populations analyzed. Densitometry analysis showed that TxP protein is 2 to 4-fold more expressed in all SbIII-resistant Leishmania spp. populations analyzed. In the second part this study, functional analysis of TxP was performed to determine whether over expression of LbTxP in the susceptible and resistant L. braziliensis and L. infantum chagasi populations would change the resistance phenotype of transfected parasites to antimony SbIII. Western blotting analysis showed that the level of TxP protein expression was 2 to 4-fold higher in transfected parasites than in the non-transfected ones. IC 50 analysis showed that susceptible L. braziliensis population that overexpress of TxP protein are 2-fold more resistant to SbIII compared to its parental non-transfected population. On the other hand, overexpression of TxP in the resistant L. braziliensis population caused inversion of resistance phenotype. The resistant parasites after TxP transfection became very susceptible to SbIII. In addition, overexpression of TxP enzyme in the susceptible and resistant L. infantum chagasi populations did not alter the resistance phenotype to SbIII. In conclusion, our functional analysis results showed that the enzyme Tryparedoxin peroxidase is involved in the antimony-resistance phenotype in L. braziliensis.

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Nesse sentido, no presente estudo foram selecionados sete produtos naturais bioativos (PNB) e um derivado de produto natural (dPNB) e suas atividades tripanocida e leishmanicida foram determinadas e/ou confirmadas. A eleuterine, a tiofenonaftoquinona (TNQ) e a aurentiacina foram descritas como leishmanicidas pela primeira vez, sendo suas atividades antiamastigota de 99, 99 e 98 %, respectivamente. O lapachol, a chalcona 1 e a chalcona 2 tiveram o efeito leishmanicida confirmado com atividade de 85, 99 e 99 %, respectivavente. Nenhuma substância foi considerada ativa no modelo de T. cruzi utilizado. Devido às quantidades de substâncias disponíveis, apenas o lapachol e a TNQ tiveram seus mecanismos de ação leishmanicida estudados. As concentrações inibitórias de 50% (CI50) da TNQ foram inferiores àquelas do lapachol em promastigotas (2 e 25 μM), amastigotas recuperadas de lesão (22 e 224 μM) e amastigotas intracelulares (7,4 e 84 μM). A razão entre a CI50 em amastigotas intracelulares e macrófagos foi utilizada para o cálculo do índice de seletividade, sendo este 3,8 para o lapachol e 7,7 para a TNQ. Os PNB e dPNB leishmanicida foram avaliados quanto à atividade inibitória da enzima tripanotiona redutase (TR), sendo que nenhum foi capaz de inibir a enzima. Os efeitos induzidos por TNQ e lapachol sobre a atividade mitocondrial de promastigotas foram avaliados por citometria de fluxo e respirometria. O tratamento com lapachol induziu perda do potencial de membrana mitocondrial e reduziu o consumo de oxigênio pelos parasitos. Por sua vez, a TNQ não alterou esses parâmetros. Análises de microscopia eletrônica de transmissão mostraram que o tratamento com lapachol ou TNQ induziu danos no complexo de Golgi e na bolsa flagelar, formação de vesículas e perfil de autofagia. O lapachol, mas não a TNQ, também induziu alterações ultraestruturais nas mitocôndrias das promastigotas. Em conjunto, os resultados permitem propor que a mitocôndria seja um importante alvo celular para o lapachol. Uma vez que a TNQ não causou alterações na mitocôndria dos parasitos, mas induziu danos em outras organelas, pode-se propor que seu mecanismo de ação esteja relacionado à indução de estresse oxidativo. Este trabalho reforça a importância dos PNB na descoberta de novas substâncias bioativas, as quais podem ser objeto de estudos de mecanismos de ação, a fim de se expandir o conhecimento disponível para o processo de desenvolvimento de novos fármacos usados para o tratamento de endemias que afligem milhões de pessoas como as leishmanioses e a doença de Chagas. / In Brazil, Chagas disease and leishmaniasis cause great impact on public health. The drugs currently used to treat these diseases have limitations that make necessary the search for new therapeutic alternatives. In this context, seven bioactive natural products (BNP) and one derivative (BNPd) were selected for investigations. Their trypanocidal and leishmanicidal activities were detected or confirmed. Eleutherine, naphthothiophenquinone (TNQ) and aurentiacin had their leishmanicidal activity described for the first time in this study, reducing almost 100% of the parasites growth. Lapachol, chalcone 1 and chalcone 2 had their leishmanicidal activity confirmed. None were active on T. cruzi intracellular amastigote and trypomastigote model. Because of the available amounts of compounds, only lapachol and TNQ had their leishmanicidal mechanism of action studied. The inhibitory concentrations of 50% of the parasite growth (IC50) induced by TNQ were inferior of that of lapachol in promastigotes (2 μM and 25 μM), lesion derived amastigotes (22 μM and 224 μM) and intracellular amastigotes (7.4 μM and 84 μM). The ratio between the IC50 on macrophages and intracellular amastigotes was used to calculate the selectivity index, lapachol’s was 3.8 and TNQ’s was 7.7. The leishmanicidal BNP and BNPd were evaluated as to their ability to inhibit trypanothione reductase (TR) and none of the compounds were able to inhibit the enzyme. The effects induced by the compounds on promastigotes mitochondrial activity were assessed using flow citometry and respirometry. Treatment using lapachol induced loss of mitochondrial membrane potential and reduced oxygen consumption by the parasites. On the other hand, TNQ did not alter those parameters. Transmission electron microscopy showed that lapachol and TNQ induced damage to the Golgi complex, flagellar pocket, formation of vesicles and autophagy profile. Lapachol, but not TNQ, induced ultrastrucutral alterations on promastigotes mitochondria. These results suggest that mitochondria are an important target for lapachol. As TNQ did not alter the parasites mitochondrial function or structure, but induced important ultrastructural alterations in other organelles, we can assume that its mechanism of action could be related to induction of oxidative stress. The present work reinforces the importance of BNP in the discovery of new active compounds that can be used for mechanism of action studies, contributing to the knowledge required for drug development to treat diseases that afflict millions of people worldwide such as leishmaniasis and Chagas diseases