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Previous issue date: 2012 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa René Rachou / Triparedoxina peroxidase (TxP) é uma enzima que pertence à família das. peroxiredoxinas e participa da defesa antioxidante,por metabolizar peróxido de hidrogênio em moléculas de água. Dados da literatura têm mostrado que parasitos resistentes à droga podem aumentar os níveis de TxPjunto com outras enzimas, protegendo-os contra o estresse oxidativo. Inicialmente neste trabalho, avaliamos os níveis de mRNA do gene TxP e a expressão da enzima Triparedoxina peroxidase em populações de L. amazonensis, L. braziliensis,L. infantum chagasi e L. guyanensis. sensíveis e resistentes ao antimonial trivalente (SbIII). Estas populações apresentam resistência à concentração de SbIII de 4 a 20 vezes maior comparada aos seus respectivos pares sensíveis. O nível de mRNA do gene TxP, determinado por northern blot e RT-PCR quantitativo em tempo real, foi maior nas populações resistentes de L. amazonensis e L. braziliensis, enquanto que o Northern blotting mostrou maior. expressão do gene TxP na população resistente de L. guyanensis. Por outro lado, nenhuma diferença foi observada no nível do mRNA do gene TxP nas populações sensíveis e resistentes de L. infantum chagasi. Análises de southern blot mostraram que o gene cTxP não está amplificado no genoma das populações resistentes de Leishmania spp. analisadas. A expressão proteica foi determinada por ensaios de Western blotting. utilizando anticorpo policlonal contra a proteína recombinante TxP de T. cruzi. Análises do alinhamento de aminoácido da proteína TxP de T. cruzi e Leishmania spp. mostraram um alto grau de identidade entre estas sequências. O anticorpo anti-TcTxP reconheceu um polipeptídio de 25 kDa em todas as populações de Leishmania spp. analisadas.. Análises de densitometria mostraram que a proteína cTxP está 2 a 4 vezes mais expressa em todas as populações resistentes de Leishmania spp. analisadas. Na segunda parte deste estudo, ensaios funcionais da TxP foram realizados para determinar se a superexpressão da LbTxP nas populações sensíveis e resistentes de L. braziliensis. e L. infantum chagasi iria alterar o fenótipo de resistência dos parasitos transfectados ao antimonial SbIII. Análises por Western blotting mostraram que o nível de expressão da proteína TxP foi de 2 a 4 vezes maior nos parasitos transfectados quando comparado aos parasitos não-transfectados. Análises de IC50 destes parasitos mostraram que a. superexpressão do gene TxP na população de L. braziliensis sensível aumentou 2 vezes a resistência ao SbIII, quando comparado à população parental. Por outro lado, a superexpressão de TxP na população resistente de L. braziliensis reverteu o fenótipo de resistência. Os parasitos antes resistentes, após atransfecção se tornaram muito sensíveis ao SbIII. Além disto, a superexpressão daTxP em populações sensíveis e resistentes de L. infantum chagasinão alterou o fenótipo de resistência ao SbIII.. Concluindo, nossos resultados de análise funcional mostraram que a enzima triparedoxina peroxidase está envolvida no fenótipode resistência de L. braziliensis ao antimonial. / Tryparedoxin peroxidase (TxP) is an enzyme that belongs to family of peroxiredoxins and
participates in the antioxidant defense by metabolizing hydrogen peroxide in water
molecules. Literature data have reported that drug-resistant parasites may increase the levels of TxP along with other enzymes, protecting them against oxidative stress. Initially in this study, we analyzed the TxP mRNA levels and protein expression levels in
populations of L. amazonensis, L. braziliensis, L. infantum chagasi and L. guyanensis susceptible and resistant to SbIII. These populations exhibit index of resistance to SbIII 4 to 20-fold higher compared to their respective counterparts susceptible. The level of cTxP mRNA determined by northern blot and quantitative real time RT-PCR was higher in the L. amazonensis and L. braziliensis resistant populations while that Northern blot showed
increased expression this gene in the L. guyanensis resistant population. Moreover, no
difference was observed in the level of cTxP mRNA between susceptible and resistant L.
infantum chagasi populations. Southern blot analyzes showed that the TxP gene is not
amplified in the genome of SbIII-resistant Leishmania spp. populations analyzed.
Analysis of protein expression was determined by Western blotting assays using
polyclonal antibody against the TxP recombinant protein from T. cruzi. Amino acid
alignment of TxP sequence of T. cruzi and Leishmania spp. showed a high degree of
identity among these sequences. The anti-TcTxP antibody recognized a 25 kDa
polypeptide in all Leishmania spp. populations analyzed. Densitometry analysis showed that TxP protein is 2 to 4-fold more expressed in all SbIII-resistant Leishmania spp. populations analyzed. In the second part this study, functional analysis of TxP was performed to determine whether over expression of LbTxP in the susceptible and resistant L. braziliensis and L. infantum chagasi populations would change the resistance phenotype of transfected parasites to antimony SbIII. Western blotting analysis showed that the level of TxP protein expression was 2 to 4-fold higher in transfected parasites than in the non-transfected ones. IC 50 analysis showed that susceptible L. braziliensis population that overexpress of TxP protein are 2-fold more resistant to SbIII compared to its parental non-transfected population. On the other hand, overexpression of TxP in the
resistant L. braziliensis population caused inversion of resistance phenotype. The
resistant parasites after TxP transfection became very susceptible to SbIII. In addition, overexpression of TxP enzyme in the susceptible and resistant L. infantum chagasi populations did not alter the resistance phenotype to SbIII. In conclusion, our functional analysis results showed that the enzyme Tryparedoxin peroxidase is involved in the antimony-resistance phenotype in L. braziliensis.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.arca.fiocruz.br:icict/10924 |
| Date | January 2012 |
| Creators | Andrade, Juvana Moreira |
| Contributors | Murta, Silvane Maria Fonseca, Nahum, Laila Alves, Kalapothakis, Evanguedes, Araújo, Flávio Marcos Gomes, Murta, Silvane Maria Fonseca |
| Publisher | s.n. |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da FIOCRUZ, instname:Fundação Oswaldo Cruz, instacron:FIOCRUZ |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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