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Cristiane Santos Nascimento Uso de método de biologia molecular....pdf: 1323686 bytes, checksum: caf3acf13d85858d02cc05e45a821e9c (MD5)
Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, Bahia, Brasil / INTRODUÇÃO: A leishmaniose visceral humana (LVH) é uma importante causa de morbidade e mortalidade no Brasil. Apesar dos avanços no conhecimento da epidemiologia da LVH, ainda existem lacunas importantes nas informações sobre os principais reservatórios desta zoonose. A técnica validada para avaliação da infectividade de reservatórios, xenodiagnóstico, é um método laborioso, demorado e difícil de executar, portanto, inapropriado para a triagem de grande número de animais. A padronização de método capaz de quantificar a carga parasitária presente em diferentes tecidos pode oferecer respostas importantes sobre a epidemiologia e a prevenção da LVH. OBJETIVO: Avaliar a carga parasitária em diferentes amostras biológicas de cães naturalmente infectados por Leishmania chagasi, utilizando método de biologia molecular quantitativo, PCR real-time (qPCR). MÉTODOS:Entre nov/2004 e abr/2007, foram realizados seis inquéritos soro-epidemiológicos em duas áreas endêmicas para LVH. Os cães soropositivos foram eutanasiados e submetidos a: exame de cultura, parasitológico direto e exame histológico para confirmação da infecção. Amostras de sangue periférico e fragmento de pele foram coletadas em todos os animais para determinação da carga parasitária. Adicionalmente, coletou-se também swab da conjuntiva, aspirado de medula óssea e linfonodo para realização do teste de qPCR nos cães incluídos no último inquérito (abr/2007). A técnica de qPCR foi padronizada utilizando um par de primers LEIF e LEIR e sonda LEIP selecionados no gene SSu rRNA. A seleção dos primers e sonda foi realizada utilizando o programa Primer Express (Perkin-Elmer-Applied Biosystems). A sonda fluorogênica foi sintetizada utilizando uma molécula FAM ligada na extremidade 5‟ e TAMRA ligada à extremidade 3‟(Perkin-Elmer -Applied Biosystems). Para determinar a carga parasitária foi realizada curva padrão com o DNA obtido da cultura de L. chagasi em concentrações variando de 101 a 107 parasitas/ml. Cada ponto da curva foi testado em triplicata. RESULTADOS: Dos 98 cães soropositivos identificados, foi detectado DNA de Leishmania em 57% das amostras de sangue total, em 56% das amostras de pele e em 100% das amostras de medula óssea, linfonodos e swab da conjuntiva. A carga parasitária em sangue periférico e swab da conjuntiva não ultrapassou 103 parasitas/ml sendo mais comumente detectado 1 a 10 parasitas/ml. Por outro lado, em pele, medula óssea e linfonodos a carga parasitária passou de 104 parasitas/ml, além disso, as quantidades de DNA detectadas se distribuíram com maior freqüência na categoria acima de 104 parasitas/ml, notadamente em amostras de linfonodos. CONCLUSÕES: O qPCR apresentou alta sensibilidade nas amostras biológicas estudadas, particularmente em linfonodos , medula óssea e pele. Nossos resultados indicam que o qPCR pode ser utilizado numa variedade de amostras biológicas para a quantificação da carga parasitária de cães naturalmente infectados por Leishmania sp. Estudos de validação do qPCR para avaliar a capacidade de reservatórios da LV, em lugar do xenodiagnóstico, e para investigar o papel do qPCR na triagem de cães em programas de controle/prevenção da LV devem ser conduzidos. / INTRODUCTION: Human visceral leishmaniasis (LVH) is an important cause of morbidity and mortality in Brazil. Despite advances in knowledge of the epidemiology of LVH, there are still important gaps in information on the main reservoirs of this zoonotic disease. The validated technique for assessing the infectivity of reservoirs, xenodiagnosis, is laborious, time consuming and difficult to implement, therefore, inappropriate for screening large numbers of animals. A standardized method to quantify the parasite load present in different tissues may provide important answers on the epidemiology and prevention of LVH. OBJECTIVE: To assess the parasite load in different biological samples from dogs naturally infected by Leishmania chagasi using a molecular biology quantitative method, real-time PCR (qPCR). METHODS: From nov/2004 to apr/2007, six seroepidemiological surveys were conducted in two endemic areas for LVH. The seropositive dogs were euthanized and submitted to: culture, direct parasitological and histological examination to confirm infection. Blood samples and skin fragments were collected in all animals to determine the parasite load. Additionally, conjuntival swabs, bone marrow and lymph node aspirates were also collected to do qPCR in dogs included in the last survey (apr/2007). The qPCR technique was standardized using a pair of primers and probe and LEIF /LEIR and LEIP selected in the SSU rRNA gene. The selection of primers and probe was performed using the program Primer Express (Perkin-Elmer-Applied Biosystems). The fluorogenic probe was synthesized using a FAM molecule attached at the 5 'end and TAMRA linked to the 3' end (Perkin-Elmer-Applied Biosystems). In order to determine the parasite load a DNA standard curve was plotted with DNA obtained from L. chagasi culture in concentrations ranging from 101 to 107 parasites/ ml. Each point on the curve was tested in triplicate. RESULTS: Of the 98 seropositive dogs identified Leishmania DNA was detected in 57% of the whole blood samples, 56% of the skin samples and 100% of bone marrow, lymph nodes and conjuntival swabs samples. The parasite load in peripheral blood and conjuntival swab did not exceed 103 parasites/ml, and was more commonly in the range of 1-10 parasites /ml. On the other hand, skin, bone marrow and lymphnode parasite burden exceeded 104 parasites / ml, in addition, the quantities of DNA detected were distributed more frequently in the category above 104 parasites/ml, especially in lymphnodes samples. CONCLUSIONS: qPCR showed high sensitivity in biological samples studied, particularly in lymphnodes, bone marrow and skin. Our results indicate that qPCR could be used in a variety of biological samples to quantify the parasite load in dogs naturally infected by Leishmania sp. qPCR validation studies to assess potential reservoirs for VL (replacing xenodiagnosis), and to investigate the role of qPCR in dog screening programs for the control/prevention of LV should be conducted.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.arca.fiocruz.br:icict/4152 |
| Date | January 2011 |
| Creators | Nascimento, Cristiane Santos |
| Contributors | Moreira Junior, Edson Duarte |
| Publisher | s. n |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da FIOCRUZ, instname:Fundação Oswaldo Cruz, instacron:FIOCRUZ |
| Rights | Cristiane Santos Nascimento, info:eu-repo/semantics/openAccess |
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