Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Núcleo de Medicina Tropical, Progragama de Pós-graduação em Medicina Tropical, 2012. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2013-01-04T13:40:56Z
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2012_VivianeMedeirosSilva.pdf: 8808644 bytes, checksum: 9d9dc0f5cdac4641c66122653211e830 (MD5) / No Brasil, a leishmaniose visceral canina (LVC) é causada pelo parasito
Leishmania chagasi, (sin. L. infantum). Considera-se que a principal via de
transmissão da LV é por meio da picada de flebotomíneos infectados. Entretanto, formas alternativas têm sido investigadas e a picada ou ingestão de carrapatos infectados poderia ter relevância epidemiológica. A presença de L. chagasi em Rhipicephalus sanguineus poderia explicar a transmissão
do parasito na população canina em locais onde há baixa frequência de
flebotomíneos. O objetivo deste trabalho foi detectar a presença de
Leishmania spp. em R. sanguineus coletados em cães naturalmente
infectados no Distrito Federal. O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética no Uso de Animais da Faculdade de Medicina da Universidade de Brasília.
Os carrapatos foram obtidos de uma amostra de conveniência composta por 48 cães entregues por seus donos à Diretoria de Vigilância Ambiental da Secretaria de Saúde do Distrito Federal com diagnóstico suspeito ou confirmado de LVC, por meio de testes sorológicos, ou cães recolhidos por ocasião da realização do inquérito rotineiro do programa de controle de LVC no DF. Foi coletado sangue venoso dos 48 cães para avaliação sorológica
da infecção por Leishmania spp por meio das técnicas imunoenzimática e imunofluorescência indireta, ambas com antígeno bruto de L. major; do teste
imunocromatográfico rápido de duplo percurso com antígeno recombinante
K28 e aplicação da técnica de PCR para amplificação de alvos de DNA gênero-específicos. Após a identificação dos espécimes de R. sanguineus, os carrapatos foram armazenados em pools de até 10 espécimes, separando-os em grupos de machos, fêmeas e ninfas. Os carrapatos foram dissecados para retirar o intestino e glândulas salivares para extração de DNA e posterior amplificação da região conservada de 120pb de kDNA e 234pb do gene hsp70 de Leishmania spp. por meio da PCR e para cultura em meio NNN modificado. Os produtos amplificados de kDNA foram ainda submetidos à digestão com as endonucleases Hae III e BstUI e ao sequenciamento genético para identificação das espécie do parasito. Foram realizados esfregaços em lâminas coradas com Giemsa para observação direta de formas de Leishmania spp. A positividade das técnicas sorológicas aplicadas ao sangue canino foi de 66,6% pelo ELISA, destes, 81,2% pela RIFI e 56,2% do total pelo DPP, e ainda, 70,8% dos cães apresentaram pelo menos um dos três testes com resultados reagentes ou positivos. Foram coletados 130 espécimes de R. sanguineus dos 27 cães que se apresentaram ectoparasitados. Houve sucesso no isolamento em cultura de
Leishmania spp. de cinco pools de glândulas salivares e intestinos de
carrapatos coletados em quatro cães. O sequenciamento do kDNA
amplificado pela PCR a partir destas amostras demonstrou homologia com
sequências de Leishmania spp. Os produtos amplificados de kDNA a partir
de amostra sanguínea de um dos cães apresentou homologia com
sequência de L. braziliensis, no entanto, a homologia do material
amplificado a partir dos carrapatos coletados desse cão foi com uma
sequência de L. infantum. A cultura analisada por eletroforese de isoenzimas
foi identificada como L. infantum. A infecção por Leishmania nos cães, dos
quais foram coletados os pools de carrapatos positivos na cultura, foi
confirmada pela PCR. A lâmina do pool de machos de um dos cães foi a
única a apresentar formas flageladas de tripanossomatídeos, cuja
identificação não foi possível pela morfometria. Os resultados obtidos
indicam que R. sanguineus que se alimentam naturalmente em cães
naturalmente infectados por L. infantum apresentam DNA do parasito no
intestino e glândulas salivares, confirmam a presença de L. infantum viável nestes ectoparasitos,e a possibilidade de isolar L. infantum em meio de cultura. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / In Brazil, canine visceral leishmaniasis (CVL) is caused by the parasite
Leishmania chagasi (syn. L. infantum). It is considered that the principal
route of transmission of the VL is through the bite of infected sand flies. However, alternative methods have been investigated and bites or ingestion
of infected ticks could have epidemiological relevance. The presence of L. chagasi in Rhipicephalus sanguineus could explain the transmission of the
parasite in the canine population in areas where there are low frequency of
sand flies. The objective of this study was to detect the presence of
Leishmania spp. in R. sanguineus collected from dogs naturally infected in the District Federal. The project was approved by the Ethics Committee on
Animal Use of the UNB Faculty of Medicine. Ticks were obtained from a
convenience sample consisting of 48 dogs delivered by their owners to the
Environmental Surveillance Directory of Health Department of the District
Federal with suspected or confirmed diagnosis of CVL, through tests, or dogs
collected during the day routine investigation of the control program LVC in DF. Venous blood was collected from 48 dogs for serologic evaluation of
infection by Leishmania spp. by means of ELISA and indirect
immunofluorescence techniques, both with crude antigen of L. major, the
immunochromatographic dual path assays with recombinant K28 and
amplification of genus specific DNA targets by PCR. After identification of
specimens of R. sanguineus ticks were stored in pools of up to 10
specimens, separating them into groups of males, females and nymphs.
Ticks were dissected to remove the gut and salivary glands for DNA
extraction and subsequent amplification of 120pb of the conserved region of
kDNA and 234pb of the hsp70 gene of Leishmania spp. by PCR. Ticks
sample were also cultured in modified NNN culture medium. The amplified
products of kDNA were further subjected to digestion with restriction endonucleases Hae III and BstUI and gene sequencing to identify the parasite species. Smears were prepared on slides stained with Giemsa for observation of Leishmania spp. forms. The positivity of serological
techniques applied to canine blood was 66.6% by ELISA. Among positive
samples, 81.2% were also positive by IFA and 56.2% by DPP, then, 70.8% of dogs had at least one of the three tests with positive results. We collected
130 specimens of R. sanguineus of the 27 dogs that had ectoparasites.
Isolation of Leishmania spp. was successfull in five pools of salivary glands and intestines of ticks collected from four dogs. Sequencing kDNA amplified
by PCR from these samples revealed homology with sequences of
Leishmania spp. The amplified products of kDNA in a blood sample from one
of the dogs showed sequence homology to L. braziliensis, however, the
amplified material from ticks collected from this dog had homology with L.
infantum sequence. The isolate analyzed by mulilocus enzyme
electrophoresis was identified as L. infantum. The Leishmania infection in
dogs where we collected the pools of ticks which had successful parasite
isolation in culture was confirmed by PCR. The smear of the pool of male ticks collected from one dog was the only positive for flagellated
trypanosomatidae whose identification was not possible by morphometry.
Our results indicate that R. sanguineus feeding naturally in dogs naturally
infected by L. infantum had parasite DNA present in the intestine and salivary
glands, confirm the presence of viable L. infantum in these ectoparasites,
and the possibility of isolation of L. infantum in culture medium.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.unb.br:10482/12021 |
| Date | 20 July 2012 |
| Creators | Silva, Viviane Medeiros |
| Contributors | Gonçalves, Rodrigo Gurgel, Romero, Gustavo Adolfo Sierra |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UnB, instname:Universidade de Brasília, instacron:UNB |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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