Orientador : Prof. Dr. Guilherme Lanzi Sassaki / Coorientador : Prof. Dr. Arquimedes Paixão de Santana Filho / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 29/03/2017 / Inclui referências : f. 52-58 / Resumo: Oligossacarídeos do leite humano (HMOs) apresentam alta homologia com a superfície celular, já que sua biossíntese é feita a partir de mecanismos semelhantes ao da produção de glicolipídeos e glicoproteínas presentes nas células epiteliais. Conhecidas funções dos HMOs já foram relacionadas, dentre elas as principais são: 1- sua capacidade em promover o crescimento da microbiota do neonato 2- competir com a mucosa intestinal pela ligação bacteriana 3- promover a defesa do hospedeiro. No presente trabalho, foi avaliada a atividade anti-inflamatória do 2'-FL (2'- fucosil-lactose) e realizados ensaios de Docking e determinação da conformação absoluta em solução por RMN (ressonância magnética nuclear) desta molécula além do isolamento de outras frações oligossacarídicas. Para o isolamento dos oligossacarídeos foi, primeiramente, realizado um processo de deslipidificação através de centrifugação a 12.000 rpm na temperatura de 4 ºC. Feito isso, o material foi submetido à precipitação etanólica (2:1, v/v) para a remoção de proteínas, onde o sobrenadante foi então coletado e liofilizado, sendo então submetido ao processo de fracionaamento através de cromatografia líquida, em uma coluna de 30 × 4 cm (70 mL) utilizando como fase estacionária carvão ativado-150 mesh e celite 545 (1:1). Como fase móvel, um gradiente contínuo de H2O:EtOH, variando de 100:0 até 40:60 foi utilizado. Após esta etapa, visando diminuir o conteúdo de lactose, as amostras contendo HMOs foram submetidas à cromatografia em coluna de sílica. Neste primeiro processo foi obtida uma quantidade significativa de 2'-FL, porém para a purificação do LDFT foi ainda realizada fracionamento por cromatografia líquida de troca iônica DEAE-Sepharose (Dietilaminoetil Sepharose) utilizando H2O inicialmente e depois uma solução de H2O:Íon amônio como fase móvel. Os oligossacarídeos então isolados foram avaliados quanto a sua capacidade pró e antiinflamatória, através da análise de suas capacidades em estimular receptores TLR (receptores do tipo Toll like). Quando comparado com o tratamento com LPS (Lipopolissacarídeo) (controle positivo) o 2'-FL na concentração de 0,02 mg/mL diminuiu o processo inflamatório 26,26%; 0,2 mg/mL em 24,18%; 2 mg/mL em 31,63%. Mostrando assim a capacidade anti-inflamatória deste HMO. Além disto, a partir da caracterização estrutural e estudos conformacionais por RMN verificou-se uma estrutura semelhante a anzol para o 2'-FL. Ensaios de Docking foram realizados, onde foram encontrados possíveis sítios de ligação, comprovando assim a possibilidade de interação entre receptores TLR (receptor do tipo Toll 4) e 2'-FL. Palavras-chave: Oligossacarídeos do leite humano, TLR, atividade biológica, RMN, Docking. / Abstract: Human milk oligosaccharides (HMOs) bare high homology to cellular surface in part because their biosynthesis occurs with great similarity to glycolipids and glycoproteins production mechanisms. Evidences present three major functions to these oligosaccharides; 1- prebiotic action for infant gut; 2- pathogen anti-adhesive barrier; 3- immunomodulatory activity. In the presented work were evaluated the anti-inflammatory activity of 2'-FL (2 fucosyllactose) and undertaken Docking and conformation NMR assays. The first step of the isolation process was deslipidification through centrifugation process at 12.000 rpm at 4 ºC. After that, the material was subjected to an ethanolic precipitation (2:1, v/v) aiming the protein removal where the supernatant was collected and freeze-dried. The next step was the utilization of a 30 X 4 cm (70 mL) column of activated-charcoal 150 mesh and celite 545 (1:1) seeking to obtain different fractions. A continuum gradient of H2O:EtOH was used varying from 100:0 to 40:60 as mobile phase. In this stage, a great quantitiy of 2'-FL was obtained but to achieve the LDFT fraction purification a further step was necessary. Willing to obtain LDFT, an ionic DEAE Sepharose (GE Healthcare) column was utilized with an initial water elution and later a water solution with a 2% content of amoniun ion. 2'-FL was then evaluated to its pro and anti-inflammatory capacity through the magnitude of activation of NF-kB by QUANTI-Blue measurement. When compared to the LPS treatment (positive control) 2'-FL at 0.02 mg/mL lessen the inflammatory activity by 26.26%; 0.2 mg/mL by 24.18%; 2 mg/mL by 31.63%. This result shows the anti-inflammatory capacity of this HMO. Besides this, Docking and conformational NMR assay proved the interaction between TLR4 (Toll like receptor 4) and 2'-FL and present a fish hook like structure for 2'-FL. Key words: Human Milk Oligosaccharides, TLR, NMR, Docking, Biological activity.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:dspace.c3sl.ufpr.br:1884/52217 |
| Date | January 2017 |
| Creators | Soares, Bernardo Freire Starling |
| Contributors | Santana Filho, Arquimedes Paixão de, Universidade Federal do Paraná. Setor de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Ciências (Bioquímica), Sassaki, Guilherme Lanzi |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | 83 f. : il., gráfs., tabs., application/pdf |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFPR, instname:Universidade Federal do Paraná, instacron:UFPR |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | Disponível em formato digital |
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