Un contexte réglementaire de plus en plus strict en évaluation du risque écotoxicologique des milieux aquatiques exige de renforcer les outils d'évaluation. A ce titre, l'étude des biomarqueurs de génotoxicité doit être privilégiée, compte tenu du rôle central de l'ADN dans le fonctionnement du vivant. L'exposition à des agents génotoxiques peut générer des dommages par interaction directe avec l'ADN, mais aussi indirectement, en modulant l'efficacité des mécanismes de réparation de l'ADN, ou la régulation épigénétique de l'expression des gènes. Aujourd'hui, la plupart des biomarqueurs de génotoxicité visent les dommages primaires à l'ADN ou la mutagènicité mais les effets indirects sur sa fonctionnalité sont encore peu étudiés. Dans ce contexte, à l'issue d'une analyse bibliographique comprenant la rédaction d'une revue sur les mécanismes de réparation des dommages à l'ADN chez le poisson, ce travail visait au développement méthodologique de plusieurs biomarqueurs de génotoxicité à l'aide de trois lignées cellulaires pisciaires (RTL-W1, RTGill-W1 et PLHC-1). Pour ce faire, l'essai des comètes en conditions alcalines a été décliné sous plusieurs versions dans l'objectif d'utiliser une technique de base unique permettant la mesure complémentaire de plusieurs biomarqueurs de génotoxicité : les dommages primaires à l'ADN, les activités de réparation et le niveau de méthylation des cytosines du génome. Les résultats soulignent l'intérêt des trois lignées en évaluation de la génotoxicité 1) pour détecter in vitro de manière sensible des atteintes primaires à l'ADN de natures variées à de faibles concentrations grâce à un essai des comètes modifié par une étape de digestion enzymatique avec une glycosylase (Fpg), 2) pour évaluer l'influence des contaminants sur l'activité de réparation par excision de bases (BER) via la mesure de la capacité d'incision d'un ADN substrat porteur de lésions de type 8-oxoGua par des extraits cellulaires (essai BERc). Le niveau de méthylation des cytosines (5-meCyt) des lignées RTgill-W1et RTL-W1 a été mesuré par HPLC-MS-MS, leur valeur élevée permet d'envisager le paramètre méthylation comme biomarqueur potentiel. Ce volet nécessitera cependant des étapes de validations ultérieures car il n'a pas été techniquement possible de mettre au point un essai des comètes modifié pour la mesure du niveau de méthylation de l'ADN. Plusieurs activités de réparation des lignées RTgill-W1 et RTL-W1 ont été caractérisées et révèlent de bonnes aptitudes de réparation de type " Base Excision Repair " (BER) et " Photo Enzymatic Repair " (PER) et une plus faible capacité au " Nucleotide Excision Repair " (NER), soit un profil proche de celui décrit in vivo et sans différence marquée entre les deux lignées. Les biomarqueurs développés sur les lignées cellulaires de poisson au cours de ce travail ont également été appliqués à la mesure des effets génotoxiques d'effluents issus du lessivage de revêtements routiers.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:CCSD/oai:tel.archives-ouvertes.fr:tel-00952888 |
| Date | 15 March 2013 |
| Creators | Kienzler, Aude |
| Publisher | INSA de Lyon |
| Source Sets | CCSD theses-EN-ligne, France |
| Language | fra |
| Detected Language | French |
| Type | PhD thesis |
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