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Previous issue date: 2010 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Leishmania spp são modelos de parasitas intracelulares de macrófagos que apresentam uma série de peculiaridades adaptativas nesta fase do seu ciclo biológico. A nossa hipótese é que fragmentos peptídicos da região COOH-terminal das cisteínas proteinases B de Leishmania (Leishmania) amazonensis atuem como uma dessas peculiaridades, modulando a resposta imune do hospedeiro vertebrado. Nesse trabalho, propomos definir a região bioativa (fragmento peptídico indutor da resposta imune) de dois peptídeos descritos como imunomoduladores durante a infecção experimental por L. (L.) amazonensis. Utilizando o servidor online SYFPEITHI, a partir dos peptídeos P1 (VMVEQVICFD) e P6 (EFCLGGGLCL) foi possível triar sequências peptídicas (P6.1 FCLGGGLCL, P6.2 EFCLGGGLCL, P6.3 EFCLGGGL, P6.4 CLGGGLCL, P6.5 EFCLGGGLC, P6.6 FCLGGGLC, P1.7 VMVEQVICF, P1.8 VMVEQVICFD, P1.9 MVEQVICFD, P1.10 VEQVICFD) que apresentaram um potencial de ligação favorável (escore > 8) aos dímeros de H-2 (H-2Db, H-2Kd, H-2Kk e H-2Ld). Os epítopos preditos foram sintetizados quimicamente e utilizados em ensaios ex vivo e in vitro com as linhagens de camundongos C57BL/6 (H-2Db) e BALB/c (H-2Ld). Os ensaios de quantificação dos linfócitos T CD8+ com o dimeric, H2-Db:Ig e H2-Ld:Ig complexadas aos peptídeos previstos, indicaram a presença de clones deste tipo celular para todos os peptídeos previstos, exceto para o P6.5 na linhagem C57BL/6, nos linfonodos drenantes da infecção. A propriedade de induzir proliferação de linfócitos T CD8+ in vitro foi observada apenas para sete peptídeos previstos (P6.1, P6.3, P6.4, P6.5, P6.6 P1.8 e P1.10) nos ensaios com BALB/c e apenas dois epítopos (P1.7 e P1.10) nos ensaios com C57BL/6. Adicionalmente foram realizados ensaios de interação entre o H2-Db:Ig e H2-Ld:Ig e os peptídeos sintéticos, em tempo real, pela técnica de ressonância plasmônica de superfície. Os peptídeos testados com H-2Db (P6.1, P6.3, P6.4, P6.5, P6.6, P1.7, P1.8 e P1.10) e H-2Lb (P6.2, P6.3, P6.4, P6.5, P6.6 e P1.8 e P1.9) indicaram valores de Ka (~ 10+1-10+3 M-1 s-1) e de Kd ( ∼ 10-4 s-1 - 10-6 s-1) favoráveis para formar complexos com os dímeros H-2Db e H-2Lb em pH neutro. Os valores de G < 0 destes complexos (em ambos os haplotipos), sugeriram que os mesmos existam durante a resposta imune acarretada pela infecção por L. (L.) amazonensis em camundongos. / Leishmania spp are models of intracellular macrophage parasites that show several adaptive peculiarities during that particular phase of the biological cycle. We hypothesized that peptide fragments from the COOH-terminal region of a cysteine proteinase B from Leishmania (Leishmania) amazonensis act in such peculiar way by modulating the immune response of vertebrate hosts. The aim of this work is the determination of the bioactive region (peptide fragment inducer of immune response) of two peptides described as immunomodulating during experimental infection by L. (L.) amazonensis. Using the online server Syfpeithi for P1(VMVEQVICFD) and P6(EFCLGGGLCL) peptides, we selected short sequences (P6.1 FCLGGGLCL, P6.2 EFCLGGGLCL, P6.3 EFCLGGGL, P6.4 CLGGGLCL, P6.5 EFCLGGGLC, P6.6 FCLGGGLC, P1.7 VMVEQVICF, P1.8 VMVEQVICFD, P1.9 MVEQVICFD, P1.10 VEQVICFD) with favorable binding potential (score > 8) to H-2 dimmers (H-2Db, H-2Kd, H-2Kk and H-2Ld). The predicted epitopes were chemically synthesized and used for ex vivo and in vitro assays with isogenic mice C57BL6 (H-2Db) and BALB/C (H-2Ld). We have also performed a quantification assay of CD8+ T lymphocytes in draining lymph node from lesion. In this assay, we used dimeric, H2-Db:Ig and H2-Ld:Ig, complexed to predicted peptides. The results indicated the presence of CD8+ T lymphocytes clones, for all tested peptides, excep for P6.5 in C57BL/6 mice. The capacity to induce CD8+ T lymphocytes blastogenesis, in vitro, was only observed for seven predicted peptides (P6.1, P6.3, P6.4, P6.5, P6.6 P1.8 and P1.10) in the assay with BALB/c mice cells and only for two peptides (P1.7 and P1.10) in C57BL/6 mice cell assay. Additionally, we performed a binding assay between H2-Db:Ig and H2-Ld:Ig and the synthetic peptides, in real time, by surface plasmon resonance. The peptides tested with H-2Db (P6.1, P6.3, P6.4, P6.5, P6.6, P1.7, P1.8 and P1.10) and H-2Lb (P6.2, P6.3, P6.4, P6.5, P6.6, P1.8 and P1.9) indicated values of Ka (~ 10+1-10+3 M-1 s-1) and Kd (∼ 10-4 s-1 - 10-6 s-1 ) favorable to form complexes with H-2Db e H-2Lb dimmers at neutral pH. The G < 0 values of these complexes (for both haplotypes), suggest that they can exist during the immune response caused by L. (L.) amazonensis infection in mice.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.arca.fiocruz.br:icict/6980 |
| Date | January 2010 |
| Creators | Silva, Franklin Souza da |
| Contributors | Caffarena, Ernesto Raul, Pereira, Mirian Claudia de Souza, Cavalcanti Júnior, Geraldo Barroso, Silva Júnior, Floriano Paes, Alves, Carlos Roberto |
| Publisher | Instituto Oswaldo Cruz |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da FIOCRUZ, instname:Fundação Oswaldo Cruz, instacron:FIOCRUZ |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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