Plantas transgênicas constituem interessantes alternativas para a produção de compostos com elevado valor agregado como polímeros industriais, proteínas farmacológicas e lipídios nutracêuticos. Como candidata à biofábrica, a cana-de-açúcar (Saccharum spp.) apresenta características agronômicas favoráveis, além de versatilidade de matéria-prima, que é empregada em fins tradicionais, como produção de álcool e açúcar, e até mesmo para geração de energia ou como forragem para alimentação de gado. Em nutrição animal, uma molécula bastante estudada é o ácido linoleico conjugado (CLA), que tem atividades anticarcinogênica, antidiabética, antiaterosclerose e moduladora do sistema imune e metabolismo de lipídios. O isômero t10,c12- CLA tem sido particularmente promissor na agropecuária por conta de inibição da síntese de gordura do leite e na melhoria do desempenho reprodutivo de vacas. Com o objetivo de avaliar a cana-de-açúcar como sistema biotecnológico para produção de CLA, o gene da isomerase do ácido linoleico de Propionibacterium acnes (pai) foi isolado e clonado, previamente caracterizado em Escherichia coli e, em seguida, utilizado na biolística de calos embriogênicos para regeneração de plantas transgênicas. No sistema procariótico, foi induzida a expressão de pai e a proteína heteróloga foi verificada como uma banda de 50 kDa, porém não houve alteração evidente do perfil de ácidos graxos da bactéria. Na cotransformação de cana-de-açúcar, o vetor pHA9, que contém o gene de seleção da neomicina fosfotransferase (nptII), foi bombardeado com uma das duas construções desenvolvidas com o promotor da poliubiquitina 1 de milho (pUbi1) dirigindo a expressão de pai adicionado ou não de sequência sinal da proteína de reparo de DNA recA para direcionamento para cloroplasto. Das cultivares CTC2 e IACSP9303046, foram obtidas eficiências de transformações de 2,2% e 1,7-7,1%, respectivamente. Um total de 156 plântulas foram regeneradas após regime de seleção com geneticina. Em seguida, 115 plântulas transgênicas foram identificadas por PCR para nptII e, entre essas, 29 e 48 foram PCRpositivas para pai e rec-pai, respectivamente. De 50 plantas aclimatizadas, 12 foram analisadas por Southern blot para nptII e 4 para pai, confirmando-se a transformação genética. Para comprovar a expressão de mRNA de pai, 27 plantas foram averiguadas por RT-PCR e RT-qPCR e indicaram produção de transcritos estudados. A análise de expressão das proteínas de folha por Western blot em 21 plantas selecionadas não produziu resultados conclusivos quanto à detecção de PAI. Essas mesmas foram analisadas por Cromatografia Gasosa, mas não foi detectado acúmulo de CLA. Embora seja possível a introdução e expressão do gene pai em cana-de-açúcar, é necessário avaliar em maior detalhe os fatores que possam afetar positivamente a produção de CLA, como tipo de tecido, compartimentos subcelulares para direcionamento proteico ou coexpressão de fosfolipases. / Transgenic plants are attractive alternatives for the production of high value compounds as industrial polymers, pharmacological proteins and nutraceutical lipids. As a candidate for biofactory, sugarcane presents favorable agronomic characteristics and versatility of raw material which is used for traditional purposes such as ethanol and sugar production and even for power generation or as forage feeding of cattle. In animal nutrition, a widely studied molecule is the conjugated linoleic acid (CLA), which has anticarcinogenic, antidiabetic, antiatherosclerosis and immune system and metabolism of lipids modulator activities. The isomer t10,c12-CLA has been particularly promising in agriculture because of inhibition of milk fat synthesis and improvement of the reproductive performance of cows. Aiming to evaluate the sugarcane as a system for biotechnological production of CLA, the linoleic acid isomerase gene from Propionibacterium acnes (pai) was isolated and cloned, previously characterized in Escherichia coli and then used for biolistic of embryogenic calli for regenerating transgenic plants. In the prokaryotic system, the expression of pai was induced and the heterologous protein was verified as a band of 50 kDa, but there was no obvious change in fatty acid profile of the bacterium. In cotransformation of sugarcane, pHA9 vector containing the selection gene neomycin phosphotransferase (nptII) was bombarded with one of the two constructions developed with the promoter of maize polyubiquitin 1 (pUbi1) driving the expression of pai, either added or not with the signal sequence of DNA repair protein recA for targeting to chloroplast. Cultivars CTC2 and IACSP93-3046 were obtained with transformation efficiencies of 2.2% and 1.7 a 7.1%, respectively. A total of 156 plantlets were regenerated after selection with geneticin regimen. After that, 115 transgenic plantlets were identified by PCR for nptII and among then, 29 and 48 were PCR-positive for pai and rec-pai, respectively. Of 50 acclimatized plants, 12 were analyzed by Southern blot for nptII and 4 for pai, confirming the genetic transformation. In order to prove the expression of pai mRNA, 27 plants were verified by RT-PCR and RT-qPCR and indicated the production of the studied transcripts. Expression analysis of leaf proteins by Western blot in 21 plants selected produced no conclusive results regarding the detection of PAI. Those were analyzed by gas chromatography and no accumulation of CLA was detected. Although it was possible to introduce and express the pai gene in sugarcane, it is necessary to evaluate in more detail the factors that may positively affect the production of CLA, as tissue type, subcellular compartments for protein targeting or coexpression of phospholipases.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-26112010-145918 |
| Date | 09 November 2010 |
| Creators | Bortoleto, João Fernando |
| Contributors | Figueira, Antonio Vargas de Oliveira |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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