O RNA de interferência (RNAi) é um processo envolvido com o silenciamento pós-transcricional de genes, sendo elucidado por moléculas de RNAs de dupla fita de 21-25 nucleotídeos, os small interfering RNA (siRNA), que ocorre naturalmente em uma ampla variedade de animais, plantas e microrganismos. Esse processo têm demonstrado potencial utilização para o tratamento de doenças em que se observa a super-expressão de genes, pois apresentam diversas vantagens como possibilidade de se utilizar esse mecanismo regulatório apenas pelo conhecimento da sequência do gene terapêutico, menores efeitos tóxicos e alta especificidade. Contudo, o principal desafio consiste no desenvolvimento de vetores seguros e eficazes que permitem a utilização do siRNA como terapia, visto que permitem a proteção do siRNA contra degradação enzimática, apresentam meia-vida prolongada na corrente sanguínea e propiciam um efetivo escape endossomal. Nesse sentido, nanopartículas de cristais líquidos associados ao polímero catiônico polietilenoimina (PEI) foram avaliadas como potenciais vetores não-virais para o siRNA específico para a proteína-1 relacionada à tirosinase (TRP-1), como alternativa para o tratamento tópico do vitiligo. Para isso, os cristais líquidos contendo o PEI foram complexados ao siRNA e avaliados quanto à estrutura líquido cristalina por microscopia de luz polarizada e por difração de raios-X a baixo ângulo (SAXS), tamanho de partícula/polidispersividade, potencial zeta e eficiência de complexação. A citotoxicidade dos sistemas foi avaliada em melanócitos melan-A pelo ensaio do MTT e por citometria de fluxo e, a avaliação da transfecção celular foi realizada por microscopia de fluorescência e por citometria de fluxo. Os diferentes sistemas contendo o polímero PEI apresentaram estruturas líquido cristalinas de fase hexagonal e de fase lamelar pela análise por SAXS, no entanto, a análise sob microscopia de luz polarizada, demonstrou estruturas de fase hexagonal, lamelar e isotrópica. A análise do tamanho de partícula mostrou a presença de sistemas nanoestruturados que foram capazes de se complexar ao siRNA na concentração de 10 ?M. Os estudos em cultura de célula demonstraram a maior viabilidade das células melan-A após tratamento com as nanodispersões líquido cristalinas formadas por monoleína (MO), ácido oleico (AO) e PEI, em relação ao polímero catiônico PEI em sua forma livre. Em relação à transfecção celular por microscopia de fluorescência e por citometria de fluxo foi possível observar a elevada eficiência de transfecção das nanodispersões líquido cristalinas formadas pelo sistema MO:AO:PEI. Resultados de inibição da expressão da proteína TRP-1 foram observadas em células melan-A por Western Blotting, após administração das nanodispersões líquido cristalinas associadas ao siRNA-TRP-1 específico. As nanodispersões liquido cristalinas estudas também proporcionaram maior liberação de siRNA na pele em modelo animal. Esses resultados, demonstram a potencial utilização desses sistemas para a terapia anti-sense de doenças cutâneas como o vitiligo, representando assim, uma importante contribuição para a terapia gênica tópica desta doença / The RNA interference (RNAi) is a process involved with the post-transcriptional gene silencing being elucidated by double-stranded RNA molecules of 21-25 nucleotides, the small interfering RNA (siRNA) that occurs naturally in a wide variety of animals, plants and microorganisms. This process has shown potential use for the treatment of diseases in which there is overexpression of genes, as they offer several advantages such as the possibility of using this regulatory mechanism just by knowing the sequence of the therapeutic gene, lower toxicity and high specificity. However, the main challenge is to develop safe and effective vectors that enable the use of siRNA as a therapy, since they allow the protection of siRNA against enzymatic degradation, have prolonged half-life in the bloodstream and provide an effective endosomal escape. Accordingly, liquid crystal nanoparticles associated with the cationic polymer polyethylenimine (PEI) were evaluated as potential non-viral vectors for specific siRNA for the protein related to tyrosinase-1 (TyRP-1) as an alternative for the topical treatment of vitiligo. For this, the liquid crystals containing PEI were complexed to siRNA and evaluated for liquid crystalline structure by polarized light microscopy and X-ray diffraction (SAXS), particle size / polydispersity index, zeta potential and complexation efficiency. The cytotoxicity of the systems was evaluated by MTT assay and flow cytometry in melan-A melanocytes and the evaluation of cellular uptake was performed by fluorescence microscopy and flow cytometry. The different systems containing the polymer PEI exhibited liquid crystalline structures of hexagonal and lamellar phases by SAXS analysis, however, the analysis under polarized light microscopy showed liquid crystalline structures of hexagonal phase, lamellar and isotropic. The analysis of particle size showed the presence of nanostructured systems that were capable of complexing to the siRNA at concentration of 10 ?M. Studies in cell culture demonstrated a higher viability of melan-A cells after treatment with the liquid crystalline nanodispersions formed by monolein (MO), oleic acid (OA) and PEI in relation to the cationic polymer PEI in its free form. Regarding cellular uptake by fluorescence microscopy and flow cytometry was observed the high efficiency in uptake melan-A cells mediated by liquid crystalline nanodispersions formed by system MO:OA:PEI. Results inhibition of the expression of TyRP-1 protein were observed by Western Blotting in melan-A cells, after administration of liquid crystalline nanodispersions associated with specific siRNA-TyRP-1. The liquid crystalline nanodispersions evaluated also provided greater release of siRNA in the skin in an animal model. These results demonstrate the potential use of these systems for antisense therapy of skin diseases such as vitiligo, thus representing, an important contribution to the topical gene therapy for this disease
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-05112015-103546 |
| Date | 04 September 2015 |
| Creators | Tofani, Larissa Bueno |
| Contributors | Bentley, Maria Vitoria Lopes Badra |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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