La transcription est une étape fondamentale dans l'expression des gènes. Cependant, elle reste incomplètement caractérisée dans les cellules vivantes. Pour mieux comprendre la dynamique de la transcription, notre laboratoire a amélioré le système de marquage d'ARN en utilisant la séquence codante pour MS2, facilement fusionnée avec le promoteur d'intérêt et inséré copie unique dans deux lignées cellulaires HeLa cellules. Cette construction permet une vue quantitative de la transcription, a l’échelle de la molécule unique, en temps réel. Nous avons trouvé que le VIH-1 est transcrit par des groupes de polymérases nominés convois. La transcription oscille de manière aléatoire avec des périodes actives (ON) et inactives (OFF) et est contrôlée indépendamment.Sur la base de cette découverte, nous avons étudié: (i) comment l'architecture de différents promoteurs de mammifères contrôle la cinétique transcriptionnelle; et (ii) le rôle du transactivateur transcriptionnel (Tat), le régulateur principal de la transcription du VIH-1, dans les cellules vivantes. Pour traiter ces questions, une nouvelle méthode de modélisation a été établi, combinant l'information des fluctuations transcriptionnelles avec différentes résolutions temporelles. Cela a donné une vue complète et précise du processus stochastique, décrit par le modèle de Markov. Cinq des six promoteurs de mammifères pourraient être définis par trois états, probablement contrôlés par des mécanismes différents. Le passage entre ces états est défini par les constantes de vitesse et l'écart entre eux pourrait potentiellement expliquer la différence dans la quantité d'ARN produit. De manière intéressante, nous avons constaté que les taux de passage entre les états inactifs et profondément silencieux sont la marque distinctive de différents promoteurs, suggérant que les événements cruciaux définissant les profils transcriptionnels sont en fait des événements pré-transcriptionnels.Pour étudier le rôle de Tat, des lignées cellulaires contenant un rapporteur du VIH-1 et une quantité différente de Tat ont été produites. Avec cette approche décrite ci-dessus, nous avons montré que Tat, précédemment caractérisé en tant qu'acteur dominant dans la libération de la polymérase en pause, agit longtemps avant que la transcription soit initiée. Ces résultats frappants apportent de nouvelles perspectives concernant la dynamique transcriptionnelle du VIH-1 contrôlée par Tat. / Transcription is a fundamental step in gene expression. However, it is incompletely characterized in single living cells. To address this question, our laboratory developed the improved RNA tagging system using MS2-binding protein that could easily be fused with the promoter of interest inserted in a single copy in HeLa cell lines. This construct allows quantitative, single molecule view of the transcription in a real time. We have found that HIV-1 is transcribed by groups of closely spaced polymerases referred as convoys. The transcription oscillates randomly between active (ON) and inactive (OFF) periods that are controlled independently.On the basis of this discovery, we further investigated: (i) how architecture of different mammalian promoters controls the transcriptional kinetics; and (ii) the role of transcriptional transactivator (Tat), the master regulator of in HIV-1 transcription in living cells. To address this, new pipeline for the quantification was established, combining the information of transcriptional fluctuations with different temporal resolutions. This gave the full and precise view of the stochastic switching, described by the Markov model. Five of six mammalian promoters could be defined by three states, probably controlled by different mechanisms. Switching between them is defined by the rate constants and the discrepancy among them could potentially explain the difference in the amount mRNA produced. Interestingly, we found that switching rates between inactive, deeply silent states are the hallmark of different promoters, suggesting that the crucial events defining the transcriptional profiles are in fact pre-transcriptional events.To address the role of Tat, cell lines containing HIV-1 reporter and different amounts of Tat were produced. With the above described approach, we found that Tat, previously characterized as dominant player in the release of the paused polymerase, actually acts long before the transcription is initiated. These striking results bring new insights of HIV-1 transcriptional dynamics controlled by Tat.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2018MONTT080 |
| Date | 22 November 2018 |
| Creators | Kozulic-Pirher, Alja |
| Contributors | Montpellier, Bertrand, Édouard, Basyuk, Eugénia |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
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