Immer mehr Berichte deuten darauf hin, dass nicht-kodierende RNAs an der Regulation des Immunsystems beteiligt sind. In dieser Arbeit wurden nicht-kodierende RNAs identifiziert, die durch zwei unterschiedliche immunologische Prozesse in zwei verschiedenen Zelltypen reguliert wurden. Zum einen wurde das Transkriptom von Multiplen Myelom-Zellen in Abhängigkeit von der Interleukin 6-Stimulation untersucht. Dabei wurden einige sehr lange, IL 6-regulierte macroRNAs identifiziert, die STAIRs (STAT3-induced RNAs). Bei den STAIRs handelt es sich wahrscheinlich um funktionelle, kontinuierliche, nicht-kodierende macroRNAs, die im Zellkern angereichert sind. Einige STAIRs dienen eventuell zusätzlich oder ausschließlich als Primärtranskript für gespleißte, lange ncRNAs (lncRNAs), die weitere Funktionen in der Zelle ausüben können. Die STAIRs weisen eine große Bandbreite an Gewebsspezifität auf und bei den Untersuchungen in dieser Arbeit zeigten sich Hinweise, dass sie sich für verschiedene Krebserkrankungen als Biomarker eignen könnten. Die zweite Transkriptomanalyse wurde bei der Aktivierung naiver T Zellen durchgeführt. Dabei offenbarte sich, dass die Zellen bei diesem Prozess einen dramatischen Wechsel ihres Transkriptionsprogrammes vollziehen und eine Vielzahl nicht Protein-kodierender Gene reguliert werden. Es wurde die Regulation von ncRNAs, die bisher noch nicht im Zusammenhang mit T Zellen beschrieben wurden, beobachtet und erneut unbekannte, differentiell exprimierte Bereiche identifiziert. Im Anschluss wurde STAIR18, eine nicht-kodierende RNA, die durch die beiden untersuchten Signalwege reguliert wird, eingehender untersucht. Es zeigte sich, dass STAIR18 im menschlichen Genom dupliziert ist und beide Loci die gespleißte, lange ncRNA152 in diversen Varianten transkribieren. ncRNA152 ist hauptsächlich im Zytoplasma lokalisiert und befindet sich dort anscheinend in perinukleären Aggregaten. Die verschiedenen ncRNA152-Isoformen scheinen unter-schiedliche Funktionen auszuführen. Einerseits ist eine Wirkung als competing endogenous RNA wahrscheinlich. Eine weitere Aufgabe der ncRNA152 scheint darin zu bestehen, das STAT3-Primärtranskript zu stabilisieren oder dessen Prozessierung zu fördern.:1 Einleitung 1
1.1 Nicht-kodierende RNAs 1
1.1.1 Funktionen langer nicht-kodierender RNAs 2
1.1.2 Lange nicht-kodierende RNAs in Krebserkrankungen 4
1.2 Die Signaltransduktion von IL-6 und STAT3 5
1.2.1 Die IL-6/STAT3-Signalkaskade 5
1.2.2 Der Transkriptionsfaktor STAT3 7
1.2.3 Interleukin 6 und STAT3 in Krebserkrankungen 9
1.2.4 STAT3-regulierete nicht-kodierende RNAs 12
1.3 T-Zellen 13
1.3.1 T Zellaktivierung 14
1.3.2 Lange nicht-kodierende RNAs in T Zellen 16
1.4 Zielstellung 18
2 Material und Methoden 20
2.1 Bioinformatische Methoden 20
2.1.1 Evaluierung von Tiling Array-Daten 20
2.1.2 Evaluierung von Hochdurchsatz-Sequenzierungen 21
2.1.3 Auswertung von Mikroarray-Daten 21
2.1.4 DNA-Sequenzanalysen 22
2.1.5 Design von Oligonukleotiden 23
2.1.6 Statistische Auswertung 24
2.2 Molekularbiologische Methoden 25
2.2.1 Zellfraktionierung 25
2.2.2 Isolation von RNA 25
2.2.3 Reverse Transkription 26
2.2.4 Quantitative real-time PCR 27
2.2.5 Klonierung 29
2.3 Zellbiologische Methoden 36
2.3.1 Präparation primärer T-Helferzellen 36
2.3.2 Zellkultur und Stimulation eukaryontischer Zellen 38
2.3.3 Durchflusszytometrie 40
2.3.4 Transiente Transfektion eukaryontischer Zellen 42
2.3.5 Reportergenanalysen 44
2.3.6 Fluoreszenz in situ Hybridisierung 45
2.3.7 Gewebe- und Patientenproben 48
3 Ergebnisse 50
3.1 Identifizierung und Charakterisierung neuer STAT3-regulierter ncRNA-Gene 50
3.1.1 Genomweite Untersuchung STAT3-regulierter ncRNAs 50
3.1.2 Validierung der IL-6-Tiling Array-Daten 65
3.1.3 Intrazelluläre Lokalisation der STAIRs 67
3.1.4 Expressionsprofile der STAIRs 68
3.2 Identifizierung regulierter ncRNA-Gene während der T Zellaktivierung 72
3.2.1 Etablierung der in vitro Aktivierung primärer T Zellen 72
3.2.2 Genomweite Untersuchung regulierter RNAs während der T-Zellaktivierung 74
3.2.3 Validierung der T-Zellaktivierungs-Genomdaten 83
3.3 Untersuchung der nicht-kodierenden RNA STAIR18 / ncRNA152 83
3.3.1 STAIR18 ist im humanen Genom dupliziert 84
3.3.2 Von beiden STAIR18-Loci werden gespleißte Transkripte generiert 86
3.3.3 Regulation der ncRNA152 90
3.3.4 Untersuchung des STAIR18/ncRNA152-Promotors 96
3.3.5 Intrazelluläre Lokalisation von STAIR18 und ncRNA152 101
3.3.6 Überexpression der ncRNA152 in XG-1-Zellen 106
3.3.7 Knockdown der ncRNA152 in XG-1-Zellen 107
3.3.8 Identifizierung putativer Zielgene der ncRNA152 109
4 Diskussion 111
4.1 IL 6/STAT3 regulierte macroRNAs 111
4.1.1 Charakterisierung der STAIRs 114
4.1.2 STAIRS als potentielle Biomarker 121
4.2 Regulation von lncRNAs während der T Zellaktivierung 122
4.3 Untersuchung von STAIR18/ncRNA152 128
4.3.1 Regulation von STAIR18 und der ncRNA152 129
4.3.2 Lokalisation von STAIR18 und der ncRNA152 130
4.3.3 Manipulation der ncRNA152-Expression 131
4.3.4 Bedeutung der ncRNA152 133
5 Zusammenfassung 135
6 Summary 138
7 Literaturverzeichnis 141
8 Anhang 153
Danksagung 168
Publikationen 16969
Selbstständigkeitserklärung 170
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa:de:qucosa:12347 |
| Date | 19 June 2015 |
| Creators | Hösler, Nadine |
| Contributors | Horn, Friedemann, Schöneberg, Torsten, Universität Leipzig |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | German |
| Detected Language | German |
| Type | doc-type:doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, doc-type:Text |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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