O presente estudo tem como objetivo avaliar os mecanismos pelo qual o ácido palmítico induz atrofia muscular ou prejudica a regeneração em células C2C12. Para avaliar o efeito do AP na formação dos miotubos, células C2C12 foram diferenciadas e tratadas com ácido palmítico (AP: 0, 100 e 150 <font face = \"symbol\">mM) por 0-5 dias. Para indução in vitro de atrofia muscular os miotubos foram diferenciados por 5 dias e tratados com AP 100 <font face = \"symbol\">mM ou veículo por 48h. Nos mioblastos em proliferação foram realizados os ensaios de MTT, LDH, TUNEL e curvas de crescimento para avaliar o efeito do AP na citotoxicidade e proliferação celular e ensaio de cicatrização para avaliar se o AP prejudica a regeneração de mioblastos. Após 1 a 5 dias de diferenciação e tratamento com AP, as concentrações de 100 e 150 <font face = \"symbol\">mM induziram nas células C2C12 redução no diâmetro e tamanho das fibras tipo 1 e tipo 2 formados sem afetar a viabilidade celular ou induzir apoptose na linhagem C2C12 em comparação ao controle. Entretanto, o tratamento com AP induziu a formação de um maior números de fibras MyHC tipo 2 e menor do tipo 1. Enquanto o AP na concentração de 100 <font face = \"symbol\">mM não afeta a proliferação celular, na concentração de 150 <font face = \"symbol\">mM o AP parece prejudicar a proliferação, e após lesão, não há cicatrização completa mesmo 16 horas da lesão. A expressão de RNAm dos marcadores miogênicos (MyoD, Mstn, Myf5, MyH7 e miomesina) e dos microRNAs específicos de músculo esquelético também foram avaliadas em miotubos diferenciados e tratados ou não com AP (1 - 5 dias). Observou-se que um padrão temporal alterado de expressão dos marcadores miogênicos e dos miR-1, miR-133a e miR-206, que, provavelmente, ocorre para manter a diferenciação celular. Após 1 dia de diferenciação e tratamento com AP 100 e 150 <font face = \"symbol\">mM, observou-se um amento na expressão de atrogin-1, possivelmente indicando uma maior degradação proteica. Já nas células diferenciadas por 5 dias e tratadas com AP por 48h, observamos redução do diâmetro dos miotubos, caracterizando o processo de atrofia, aumento no perfil de expressão dos miR-133a e 206 e não observamos alterações nas proteínas relacionadas a síntese e degradação proteica analisadas. Em conclusão, Concluímos que a atrofia muscular esteja sendo mediada pelos microRNAs alterados entretanto não é mediada pela via ubiquitina-proteassoma. / The present study aims to evaluate the mechanisms by which palmitic acid induces atrophy or affects regeneration of C2C12 cells. The effect of AP (0, 100 and 150 <font face = \"symbol\">mM) on myotube formation of C2C12 cells were evaluated 0-5 days of differentiation. In order to induce muscular atrophy in vitro, myotubes were differentiated for 5 days and treated with AP 100 <font face = \"symbol\">mM or vehicle for 48h. In proliferating myoblasts MTT, LDH and TUNEL assays and cellular growth curves were performed in AP or vehicle-treated C2C12 cells so as to evaluate cytotoxicity and cell proliferation and the healing assay to analyze myoblasts regeneration. After 1 to 5 days of differentiation and treatment with AP, 100 and 150 <font face = \"symbol\">mM concentrations induced a reduction in the size and diameter of type 1 and 2 fibers formed without affecting cell viability or induce aopotosis in C2C12 cell line in comparison to the control. However, AP induced an increase in MyHC type 2 fibers whether reduced MyHC type 1 fibers. While 100 <font face = \"symbol\">mM AP did not affect cell proliferation, 150 <font face = \"symbol\">mM AP reduces C2C12 cellular proliferation, and after injury, the healing is not complete after 16h of the injury. mRNA expression of the myogenic markers (MyoD, Mstn, Myf5, MyH7 and miomesine) and of the muscle-specific microRNAs were evaluated in differentiated myotubes treated or not with AP (0-5 days). We observed an altered time pattern of expression of myogenic markers and of miR-1, miR-133a and miR- 206, which probably occurs to maintain cell differentiation. After 1 day of differentiation and treatment with AP 100 and 150 <font face = \"symbol\">mM, it was observed an increased expression of atrogin-1, possibly indicating a greater protein degradation. After 5 days of differentiation and 48h-treatment with AP, we observed reduction of myotube diameter, characterizing the atrophy process, increased expression of miR-133a and 206, and no changes were observed in the proteins related to protein synthesis and degradation analyzed. In conclusion, AP reduces myotube differentiation inducing myotube atrophy by decreasing myogenic markers and accelerating protein degradation and promotes a change in type 1 and 2 fibers proportion. In myotubes, the mechanisms by wich AP induces myotube atrophy seems to involve an increase in miR-133a and miR-206 expression.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-11022019-142538 |
| Date | 13 July 2018 |
| Creators | Paixão, Ailma Oliveira da |
| Contributors | Rodrigues, Alice Cristina |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Reter o conteúdo por motivos de patente, publicação e/ou direitos autoriais. |
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