Un contrôle précis de la maturation ovocytaire et de la ponte sont essentiels au succès de la reproduction sexuée au sein le règne animal. Ces processus sont coordonnés précisément par des signaux endocriniens et/ou environnementaux, selon les espèces, mais beaucoup reste à apprendre sur leurs régulations. Chez les cnidaires, de nombreuses méduses du groupe des hydrozoaires sont connues pour produire des gamètes en réponse à la transition nuit/jour. Pour caractériser les machineries cellulaires et moléculaires liant la réception de la lumière à l'initiation de la maturation ovocytaire, j'ai étudié la méduse hydrozoaire Clytia hemisphaerica. Mon travail de thèse s’est découpé en trois parties, chacune impliquant l'identification d'un composant moléculaire clé de ce processus.Mon étude initiale faisait partie d'une collaboration avec N. Takeda (Asamushi) et R. Deguchi (Sendai), chercheurs qui avaient, avant le début de ma thèse, identifié chez Clytia les Hormones d'Incitation de Maturation ovocytaire endogènes (MIH) comme étant des tétrapeptides de type WPRPamide, produit par clivage de deux précurseurs à neuropeptides. J'ai montré par hybridation in situ et immunofluorescence que les deux gènes précurseurs du MIH sont exprimés par un type de cellules neurosécrétrices localisées au niveau de l’ectoderme de la gonade, et que les peptides MIH sont sécrétés par ces mêmes cellules suite à une stimulation lumineuse. Cette étude a posé les bases permettant l'identification des régulateurs agissant en amont et en aval du MIH, et plus spécifiquement ceux impliqués dans la photoréception de l’ectoderme de la gonade et la réception du MIH par les ovocytes.Pour identifier le récepteur du MIH de Clytia (CheMIHR) dans les ovocytes, j'ai compilé à partir de données transcriptomiques issues de tissus de gonades, une liste de 16 protéines candidates de la famille des Récepteurs Couplés aux Protéines G (GPCR). J'ai cloné les 16 cDNAs et, utilisant une méthode de « deorphelinisation » de GPCR basée sur de la culture cellulaire (collaboration avec P. Bauknecht et G. Jékély; MPI, Tübingen), j’ai pu identifier un GPCR activée par des peptides MIH synthétiques. Sa fonction in vivo comme récepteur essentiel du MIH a été confirmée par la méthode d'édition génétique CRISPR/CAS9. La délétion ainsi produite, entraînant un déplacement du cadre de lecture au sein du gène CheMIHR, a détérioré la croissance des colonies de polypes et le comportement de ponte des méduses matures. Confirmant la fonction de CheMIHR, la maturation ovocytaire chez des mutants CheMIHR ne pouvait pas être déclenchée par la lumière ou par addition de MIH synthétiques, mais pouvait être rétablie en utilisant des analogues au cAMP, molécule connue pour agir en aval de la réception du MIH dans les ovocytes d’hydrozoaires. Des analyses phylogénétiques ont montré que Clytia MIHR est affilié à un sous-ensemble de familles de neuropeptides de bilaterians impliqués dans divers processus physiologiques, notamment la régulation de la reproduction. Des hybridations in situ sur les méduses Clytia, ont en outre montré l'expression des précurseurs de CheMIH et de CheMIHR dans des cellules neurales hors de la gonade, suggérant un rôle plus large du couple CheMIH-MIHR que la seule initiation de la maturation ovocytaire.Pour mieux comprendre la photoréception des gonades chez Clyita, j'ai montré que la ponte est sélectivement incitée par la lumière bleu-cyan, et mis en évidence, grâce à l’analyse de données de transcriptome de gonade, qu’un photopigment de la famille des Opsin (Opsin9) est hautement exprimé dans l'ectoderme. De façon saisissante, les hybridations in situ ont montré que le gène Opsin9 est exprimé dans les mêmes cellules sécrétant le MIH. L'introduction d'une mutation de changement de cadre de lecture dans le gène Opsin9 via la technologie CRISPR/Cas9 a empêché la maturation ovocytaire et la ponte des méduses mutantes en réponse à la lumière... / Tight control of oocyte maturation and of gamete release is essential for successful sexual reproduction in the animal kingdom. These processes are precisely coordinated by endocrine and/or environmental cues, depending on the species, but much remains to be learned about their regulation. Within the Cnidaria, many hydrozoan jellyfish are known to spawn mature gametes following dark/light transitions. To characterise the cellular and molecular machinery linking light reception and oocyte maturation initiation, I have studied the hydrozoan jellyfish Clytia hemisphaerica. My thesis work had three parts, each involving the identification of a key molecular component of this process.My initial study was part of a collaboration with N. Takeda (Asamushi) and R. Deguchi (Sendai), who identified the endogenous oocyte Maturation-Inducing Hormones (MIH) in Clytia as WPRPamide-related tetrapeptides, generated by cleavage of two neuropeptide precursors. I showed by in situ hybridization and immunofluorescence that Clytia MIH is produced by neurosecretory cells of the gonad ectoderm that co-express the two precursor genes, and that it is secreted upon light stimulation. This study paved the way for identification of regulators acting upstream and downstream of MIH release in the gonads, specifically the ones involved in photoreception in the gonad ectoderm, and in MIH reception by the oocytes. To identify the Clytia MIH receptor (CheMIHR) in the oocytes, I compiled a shortlist of 16 candidate G protein-coupled receptors (GPCRs) from gonad transcriptome data. I cloned all 16 cDNAs and, using a cell culture-based "GPCR deorphanization" assay (collaboration with P. Bauknecht and G. Jékély; MPI, Tübingen), identified one GPCR that was activated by synthetic MIH peptides. Its in vivo function as the essential MIH receptor was confirmed by CRISPR/Cas9 gene editing. Introduction of a frame-shift mutation in the CheMIHR gene impaired growth of Clytia polyp colonies and also the spawning behaviour of mature medusae. Confirming the function of CheMIHR, oocyte maturation in CheMIHR mutants could not be triggered by light or by synthetic MIH, but could be restored using cell-permeable analogues of cAMP, known to act downstream of MIH reception in hydrozoan oocytes. Phylogenetic analyses showed that Clytia MIHR is related to a subset of bilaterian neuropeptide hormone receptor families involved in diverse physiological processes, including regulation of reproduction. Accordingly, in situ hybridization showed the expression of Clytia MIH precursors and MIHR in non-gonadal neural cells, suggesting a wider role of Clytia MIH-MIHR besides oocyte maturation initiation.To address gonad photoreception, I showed that Clytia spawning is selectively induced by blue-cyan light, and then identified using gonad transcriptome data an opsin photopigment (Opsin9) highly expressed in the ectoderm. Strikingly, in situ hybridization showed that Opsin9 is expressed in the MIH-secreting cells. Introduction of a frame-shift mutation into the Opsin9 gene via CRISPR/Cas9 prevented oocyte maturation and spawning of mutant jellyfish in response to light. Anti-MIH immunofluorescence and rescue experiments with synthetic MIH showed that the essential function of Opsin9 is upstream of MIH release. Spawning in Clytia thus appears to be regulated by a dual function photosensory-neurosecretory cell type, perhaps retained from a distant metazoan ancestor...
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2017PA066284 |
| Date | 23 May 2017 |
| Creators | Quiroga Artigas, Gonzalo |
| Contributors | Paris 6, Houliston, Evelyn |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
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