Este trabalho consiste num estudo abrangente do sistema digestivo de espécies representativas da ordem Hemiptera, no qual dados de caráter morfológico foram integrados a informações bioquímicas e moleculares acerca das principais proteínas atuantes no processo digestivo destes animais. Para tanto, este projeto utilizou, como referência básica, um estudo prévio realizado com a espécie Bucephalogonia xanthophis (Hemiptera: Cicadellidae). As análises morfológicas desenvolvidas neste trabalho consistiram em um estudo comparativo ultraestrutural das espécies sugadoras de seiva Macugonalia leucomelas (subordem Auchenorrhyncha, Cicadellidae), Dalbulus maidis (subordem Auchenorrhyncha, Cicadellidae), Mahanarva fimbriolata (subordem Auchenorrhyncha, Cercopidae), Quesada gigas (subfamília Auchenorrhyncha, Cicadidae) e Diaphorina citri (subordem Sternorrhyncha, Psyllidae). Já a vertente molecular deste estudo buscou identificar, caracterizar e determinar a distribuição de transportadores de membrana, enzimas digestivas e outras proteínas atuantes no processo digestivo da espécie B. xanthophis. De um modo geral, as espécies da infraordem Cicadomorpha M. leucomelas, D. maidis, M. fimbriolata e Q. gigas apresentam uma organização anatômica do sistema digestivo muito semelhante ao descrito previamente para a cigarrinha B. xanthophis. Um esôfago conecta a boca ao intestino médio, que tem início na câmara de filtração (CF), que é composta pela aposição das porções anterior e posterior do intestino médio com as regiões proximais dos túbulos de Malpighi. Este órgão permite a excreção do excesso de água presente na seiva, permitindo a concentração dos nutrientes na porção mediana do intestino médio. O sistema digestivo segue por duas regiões anatomicamente distintas: o domínio cônico (DC) e o tubular (DT) do intestino médio. O intestino posterior é observado como um longo tubo livre pela hemocela a apresenta um reto dilatado, terminando em um ânus. De um modo geral, as espécies da família Cicadellidae (M. leucomelas e D. maidis) apresentam uma CF anatomicamente menos complexa do que se observa em M. fimbriolata e Q. gigas. Diferentemente das espécies da infraordem Cicadomorpha, o psilídeo D. citri exibe um sistema digestivo com uma CF relativamente ainda mais simples, sem a presença de túbulos de Malpighi. O intestino médio desta espécie também possui dois domínios distintos, mas apresentam caracteristicamente quatro apêndices de fundo cego que se projetam a partir do DT, cuja função ainda é desconhecida. Do ponto de vista ultraestrutural, as células da CF das espécies analisadas exibem adaptações relacionadas ao transporte de água e íons através da membrana, como microvilosidades apicais e invaginações da membrana plasmática basal associadas à mitocôndrias. As células da CF de D. citri possuem uma maior quantidade de organelas citoplasmáticas quando comparadas às espécies da infraordem Cicadomorpha., sugerindo uma menor atividade no processo digestivo Os enterócitos, principal tipo celular encontrado no DC e DT, exibem, em todas as espécies analisadas, microvilosidades apicais, invaginações da membrana plasmática basal associada a mitocôndrias e organelas associadas à rota intracelular de secreção. No caso particular de D. citri, as microvilosidades se mostram modificadas na forma de uma rede de lamelas, reforçadas entre si por trabéculas. Um complexo luminal de membranas pode ser observado associado às microvilosidades dos enterócitos de todas as espécies estudadas neste trabalho. Nas espécies da subordem Auchenorrhyncha, este complexo de membranas apresenta uma organização semelhante às membranas luminais em forma de chama (MLC). Este complexo se origina a partir de constrições do ápice das microvilosidades, que formam membranas que se projetam ao lúmen do intestino médio, delimitando compartimentos de acesso restrito. Por outro lado, na espécie D. citri, o complexo luminal de membranas observado é semelhante às membranas perimicrovilares modificadas (MPMm), descritos previamente em afídeos, que não forma compartimentos fechados. Os resultados apresentados neste trabalho, aliados às informações disponíveis na literatura, indicam que a organização do complexo luminal de membranas nos insetos da ordem Hemiptera é bem mais diversificada do que se presumia anteriormente, o que coloca em dúvida a visão tradicional sobre a origem evolutiva desse complexo. A compartimentalização do processo digestivo aparentemente deixou de existir no ancestral do grupo Paraneoptera, com a perda da membrana peritrófica. No entanto, o complexo luminal de membranas presente no lúmen do intestino médio de Hemiptera e Thysanoptera pode ter surgido ao longo da evolução desses grupos como um mecanismo alternativo que promova algum nível de compartimentalização da digestão. A análise do transcriptoma do intestino médio de B. xanthophis possibilitou a identificação de uma série de transportadores de nutrientes orgânicos, inorgânicos e água. A partir destes dados, foi criado um modelo para a absorção de aminoácidos baseado num cotransporte de H+ e aminoácidos através de toda a extensão do epitélio intestinal, que utiliza a energia de um gradiente eletroquímico de prótons, bombeados para o meio extracelular por V-ATPases. Tal modelo contrasta com o preconizado na literatura, que tem por base um cotransporte de aminoácidos com potássio. Os dados obtidos pelo transcriptoma também permitiram a identificação de transportadores de açúcar ao longo do intestino médio de B. xanthophis. Os açúcares absorvidos, provavelmente na forma de glicose, devem ser convertidos em trealose no citossol dos enterócitos antes de serem transportados para a hemolinfa. Os resultados apresentados neste trabalho também indicam a ocorrência de α-glicosidase no intestino médio de B. xanthophis, além de indícios de sua associação com as MLC. No entanto, sua função no processo digestivo desta espécie ainda não é conhecida. A identificação de proteinases digestivas ao longo de todo o intestino médio de B. xanthophis, principalmente catepsinas e quimotripsinas, foi surpreendente, considerando-se que sua dieta não apresenta proteínas em sua composição. Assim, estudos complementares são necessários para se averiguar a real função destas enzimas no processo digestivo desta cigarrinha. A análise molecular realizada neste trabalho permitiu uma melhor compreensão acerca do processo digestivo da espécie sugadora de xilema B. xanthophis. Os resultados obtidos sugerem a presença de diferenças funcionais significativas entre as diversas regiões do intestino médio que não se refletem na ultraestrutura dos enterócitos. A identificação de proteinases e transportadores de aminoácidos e açúcares na CF sugere que este órgão possua uma função bem mais abrangente no processo digestivo, indo além do transporte de água e concentração de nutrientes / This work presents a comprehensive study of the digestive system of representative species of the order Hemiptera, where morphological, biochemical, and molecular data are integrated for a better understanding of the digestive process occurring in these insects. This project is based on a previous study about the digestive system of the leafhopper Bucephalogonia xanthophis (Hemiptera: Cicadellidae). A comparative ultrastructural study is presented with the sap-sucking species Macugonalia leucomelas (suborder Auchenorrhyncha, Cicadellidae), Dalbulus maidis (suborder Auchenorrhyncha, Cicadellidae), Mahanarva fimbriolata (suborder Auchenorrhyncha, Cercopidae), Quesada gigas (suborder Auchenorrhyncha, Cicadidae), and Diaphorina citri (suborder Sternorrhyncha, Psyllidae). Moreover, a molecular analysis was performed regarding the identification, characterization, and distribution of significant proteins associated with the digestive process in B. xanthophis. The digestive system of the cicadomorphan species M. leucomelas, D. maidis, M fimbriolata, and Q. gigas is very similar to the one previosly described for the leafhopper B. xanthophis. The foregut is made up of a simple tube, the esophagus. The midgut starts at the filter chamber (FC) and progresses to a more posterior conical (CDM) and tubular regions (TDM). The FC is formed by the apposition between the anterior and posterior midgut, along withe the proximal segmentos of the Malpighian tubules, allowing the concentration of the nutrients in the middle midgut. The hindgut is formed by a long tube which presents a dilated rectum before ending in the anus. The FC of M. leucomelas and D. maidis are anatomically less complex than the observed in M. fimbriolata and Q. gigas. Unlike the cicadomorphan species, the CF of D. citri shows an even more simplified organization, lacking the Malpighian tubules. Although two domains of the midgut can be observed in the psyllid, four appendages with unknown function are identified projecting from the TDM. The FC cells of all studied species present ultrastructural adaptations related to the transport of ions and water, such as apical surfaces modified into microvilli, basal plasma membrane presenting several invaginations with associated mitochondria. However, the FC cells from D. citri exhibit more organelles compared to the cicadomorphan species, suggesting that its role in the digestive process is less relevant. The CDM and TDM regions are mainly formed by enterocytes, which shows, in all species, apical microvilli, basal plasma membrane infoldings with associated mitochondria and other organelles related to the secretory pathway. The microvilli of D. citri enterocytes form a complex network of lamellae, which are associated with one another through trabecullae. A luminal membrane complex can be observed associated with the microvillar tips of the enterocytes in all analysed species. The ones from the Auchenorrhyncha infraorder exhibit a membrane complex organization similar to the flame-like membrane complex. Such complex originates from constrictions of the microvillar apex which form membranes that project into the midgut lumen, delimitating restricted access compartments. Alternatively, the luminal membrane complex observed in D. citri is similar to the modified perimicrovillar membranes, previously described in aphids, which does not form closed compartments. The results presented in this work, along with available data in the literature, indicate that the organization of the digestive system in Hemipteran insects is more diverse than previously presumed, what makes the traditional view on the evolutionary origin of this complex questionable. The compartmentalization of the digestive process was apparently lost in the Paraneoptera ancestor, allied to the loss of the peritrophic membrane. However, the luminal membrane complex in the midgut lumen of Hemiptera and Thysanoptera would have evolved as an alternate mechanism promoting some degree of compartmentalization of the digestive process. The analysis of the transcriptome of B. xanthophis midgut allowed the identification of a series of organic, inorganic, and water transporters, leading to the proposal of an amino acid absorption model, based on a cotransport of H+ and amino acid. In this model, the active transport of amino acids occurs throughout the midgut and it is powered by an electrochemical gradient of protons, formed by a V-ATPase. This model is based on a different mechanism as the one proposed in the literature, which consists on a cotransport of potassium ions and amino acids. The transcriptome analysis also allowed the identification of sugar transporters along the midgut of B. xanthophis. Glucose is probably the main monosaccharide absorbed by the enterocytes, which are then converted into trehalose before being transported to the hemolymph. The results presented in this work still indicate the occurrence of α-glucosidase in the B. xanthophis midgut and show evidences of its association with the flame-like luminal membranes. However, the function of this enzyme in the digestive process of this species has yet to be discovered. The identification of digestive proteinases along the midgut of B. xanthophis, specially cathepsins and chymotrypsins, was surprising, considering that there are no proteins in xylem composition. Therefore, more studies are needed to verify the real function of those enzymes in the digestive process of this leafhopper. The molecular analysis performed in this work led to a better understanding of the digestive process in the xylem-sucker leafhopper B. xanthophis. Apparently, the detected functional differences among the midgut regions do not reflect on the enterocytes ultrastructure. The identification of proteinases and amino acid and sugar transporters in the FC suggests that this organ has a more general role in the digestive process besides the water transport and nutrient concentration
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:teses.usp.br:tde-17052017-084152 |
| Date | 08 March 2017 |
| Creators | Alexandre Hiroshi Utiyama |
| Contributors | Alberto Augusto Gonçalves de Freitas Castro Ribeiro, Joao Roberto Spotti Lopes, Denise Selivon Scheepmaker, Manuel de Jesus Simoes, Sergio Antonio Vanin |
| Publisher | Universidade de São Paulo, Ciências Biológicas (Biologia Genética), USP, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP, instname:Universidade de São Paulo, instacron:USP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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