A leishmaniose é uma doença tropical negligenciada causada por diferentes espécies do gênero Leishmania que atinge grande parte da população mais pobre do mundo e sua manifestação visceral, que é fatal se não tratada, tem se alastrado atingindo grandes cidades, aumentando o número de pessoas com risco de infecção. Dentre os medicamentos em uso, está o análogo lipídico sintético hexadecilfosfocolina (miltefosina), administrado oralmente, que age nas membranas celulares do parasita e pode induzir apoptose, mas com modo de ação não totalmente esclarecido. O primeiro local de interação desse fármaco é a membrana celular do parasita, sendo importante o conhecimento da sua forma de interação. Neste trabalho examinamos propriedades de diversos modelos de membrana com diferentes composições, levando em consideração o conhecimento existente sobre a composição da membrana plasmática da Leishmania. Assim, as membranas modelo foram vesículas unilamelares grandes e gigantes (LUVs e GUVs), de fosfolipídios puros, de misturas binárias com fosfolipídios e colesterol e ainda misturas ternárias com ceramida, um esterol presente nas membranas de Leishmania. A interação com a miltefosina foi estudada em diferentes intervalos de concentração do fármaco. Como técnicas principais utilizamos a espectroscopia de fluorescência, estática e resolvida no tempo, a espectroscopia de correlação de fluorescência, microscopia de fluorescência e confocal e imagens por tempo de vida de fluorescência. Observou-se que a interação entre o fármaco e as membranas lipídicas ocorre de diferentes formas, dependendo i) da razão molar entre o fármaco e os lipídios; ii) da concentração real do fármaco, se abaixo ou acima da concentração micelar crítica (CMC); iii) da composição do modelo de membrana e da fase lipídica da bicamada. Em concentrações abaixo da CMC, a miltefosina tem efeito de fluidificação das bicamadas, principalmente quando elas se encontram em na fase gel, mas esse efeito é pouco pronunciado na presença de colesterol, pois esse composto protege a bicamada do efeito do fármaco. Em vesículas de misturas ternárias de fosfolipídio, colesterol e ceramida em alta concentração, não há separação de fases, e a presença de 10 mol% de miltefosina promove a formação de domínios de ceramida; nas vesículas em que a ceramida está em concentração molar mais baixa, formando domínios, a separação de fases fica menos evidente com o acréscimo de miltefosina. Em razões de concentração miltefosina/lipídio elevadas, mas ainda abaixo da CMC, observa-se diminuição no tamanho das vesículas, por formação de agregados de fármaco/lipídio com porções da bicamada. Em concentrações acima da CMC, ocorrem efeitos drásticos com solubilização de partes cada vez maiores da bicamada da membrana, e esses efeitos ocorrem em tempos menores quanto maior a concentração de miltefosina. Portanto, de maneira geral, o colesterol protege a bicamada do efeito da miltefosina, mas o fármaco tem efeito pronunciado em modelos de membrana de misturas ternárias contendo ceramida. Os efeitos variam com a concentração da miltefosina, com aumento da fluidez da bicamada em baixas razões fármaco/lipídios, solubilização de pequenas porções da bicamada e diminuição do tamanho das vesículas em razões maiores, mas ainda abaixo da CMC, e acima da CMC, formação de agregados do fármaco com porções dos lipídios da bicamada e fragmentação da membrana. / Leishmaniasis is a complex of diseases part of the neglected tropical diseases caused by several species of the genus Leishmania. It reaches a large part of the poorest people in the world and its visceral form, which is fatal if left untreated, has been spread around big cities, increasing the number of people at risk of infection. Among the used drugs for the treatment, there is the synthetic lipid analogue hexadecylphosphocholine (miltefosine), orally administrated, which acts in the cell membranes and can induce apoptosis like death, but its mechanism of action is not totally clear. The first interactions site of this drug is the cell membrane, and it is important to know its mechanism of interaction. In this work we explore properties of several membrane models with different compositions, taking into account the existent knowledge about the composition of the Leishmania plasma membrane. Therefore, the model membranes were giant and large unilamellar vesicles (GUVs and LUVs), formed from pure phospholipids, binary mixtures of phospholipids and cholesterol and ternary mixtures with ceramide, a sterol present in the Leishmania membranes. The interaction with miltefosine was studied in different intervals of drug concentration. The main techniques used were the steady-state and time-resolved fluorescence spectroscopy, fluorescence correlation spectroscopy, confocal and fluorescence microscopy and fluorescence lifetime imaging. The interaction depends on i) the molar ratio of drug and lipids; ii) the real concentration of the drug, if it is below or above the critical micelle concentration (CMC); iii) the composition of the model membrane and the lipid phase of the bilayer. In concentration below the CMC, miltefosine has an effect of bilayer fluidization, mainly when it is in a more ordered phase, but this effect is less pronounced in cholesterol presence, because this compound protects the bilayers from the drug effect. In vesicles from ternary mixtures of phospholipid, cholesterol and ceramide in high concentration, there is no phase separation, and the presence of 10 mol% of miltefosine promotes ceramide domains formation; in vesicles in which ceramide is in low concentration, forming domains, the phase separation is less evident with miltefosine addition. In high concentration ratio miltefosine/lipids, but below CMC, it is observed a decrease in vesicles size with drug/lipids aggregates formation from portion of the bilayer. In concentrations above the CMC, drastic effects occur, with solubilization of bigger portions of the membrane bilayer, and the effects occur in lower times for higher drug concentration. Therefore, generally, cholesterol protects bilayer from the effect of miltefosine, but the drug has a pronounced effect in model membranes of ternary mixtures containing ceramide. The effects vary with miltefosine concentration, increasing the bilayer fluidity in lower drug/lipid ratio, solubilization of small portions of the bilayer and decrease of vesicles size in higher ratios, but still below CMC, and above CMC, formation of aggregates of the drug with portions of bilayer lipids, and membrane fragmentation.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-24112014-142136 |
| Date | 22 September 2014 |
| Creators | Barioni, Marina Berardi |
| Contributors | Ito, Amando Siuiti |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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