A pasteurelose é uma das doenças mais comuns do trato respiratório do coelho em criações comerciais e/ou em biotérios de animais destinados à pesquisa biomédica. A bactéria Pasteurella multocida é o patógeno responsável por uma série de manifestações clínicas em coelhos, incluindo rinite crônica, otite média, pneumonia, infecções no trato genital, formação de abscessos pulmonares e cutâneos, conjuntivite e septicemia hemorrágica. Porém, entre 50 e 70 % dos animais podem incubar o organismo de forma assintomática. Os fatores predisponentes para o desencadeamento dos sinais clínicos incluem acúmulo de amônia no ar (má ventilação), prenhez, aparecimento de doenças concomitantes, distúrbios no ambiente de criação ou na manipulação experimental. A doença está presente no Brasil, ocorrendo surtos com relativa freqüência, no entanto, o diagnóstico é feito com base nos sinais clínicos e necropsia. Dessa forma é difícil precisar a extensão dos prejuízos causados pela pasteurelose à cunicultura. Vacinas comerciais específicas contra a pasteurelose em coelhos não estão disponíveis no mercado. A prevenção, ainda que apresente resultados duvidosos, é realizada utilizando-se antibióticos dissolvidos na água, porém este tipo de tratamento normalmente não protege definitivamente os animais. Uma vez que não existem vacinas disponíveis e o tratamento com antibióticos não estabelece proteção contra a pasteurelose, foram desenvolvidos neste trabalho sistemas carreadores das proteínas antigênicas da membrana da P. multocida. Estes sistemas carreadores são formados por lipossomos, já conhecidos pelo seu potencial como imunoadjuvante, e por microesferas lipídicas, responsáveis por apresentar os antígenos às células apresentadoras de antígenos (APC). Inicialmente, foram obtidas colônias puras da bactéria as quais foram cultivadas em meio de crescimento específico (BHI). Os microrganismos foram isolados, rompidos e as proteínas antigênicas foram detectadas por SDS-PAGE e Western Blotting. Estes resultados mostraram que a maioria das bandas protéicas foi reconhecida pelo anticorpo policlonal contra a P. multocida. Visto que tínhamos um pool de proteínas as quais apresentavam antigenicidade, foi realizada uma solubilização incubando frações de membrana da bactéria com SDS 1 %. Este procedimento resultou em um rendimento de solubilização de 85 %. A obtenção dos proteolipossomos foi realizada pelo método da co-solubilização de lipídio, proteína e detergente. Um bom rendimento de incorporação das proteínas em lipossomos parecer estar relacionada com a metodologia utilizada para a remoção do detergente da mistura lipídio:proteína:detergente durante o processo de co-solubilização, e também com a natureza do fosfolipídio utilizado. Os resultados indicaram que a resina Calbiosorb® foi a mais eficiente para a remoção do SDS e, dentre os diversos fosfolipídios testados o que melhor incorporou as proteínas foi o DPPC, com rendimento de incorporação de 93 % e diâmetro médio de 180 nm. Além disso, o SDS-PAGE dos proteolipossomos mostrou que todas as espécies protéicas presentes no extrato bruto solubilizado foram incorporadas nos lipossomos de DPPC. O Western Blotting mostrou que as proteínas incorporadas nos lipossomos continuavam a ser reconhecidas pelo anticorpo policlonal contra a P. multocida. Para os ensaios de imunização foram separados 3 grupos de coelhos: (i) imunizados com lipossomos; (ii) imunizados com extrato bruto solubilizado (EBS); (iii) imunizados com os proteolipossomos. Após 21 dias de imunização com as preparações descritas, os animais foram infectados com 105 ufc de bactéria. Todos os animais vacinados previamente com lipossomos ou EBS foram a óbito enquanto que os animais vacinados com os sistemas de proteolipossomos apresentaram sobrevida de 95 %. Além disso, um grupo controle vacinado com a bactéria atenuada na presença de hidróxido de alumínio como imunoadjuvante apresentou uma sobrevida de apenas 30 %, indicando que a vacina convencional não apresenta uma proteção satisfatória contra a pasteurelose. O soro dos animais vacinados com lipossomo, EBS e proteolipossomos foram coletados semanalmente antes e após a infecção experimental para a detecção da produção de anticorpos IgG, IgM e IgA, utilizando-se a técnica de ELISA. Como esperado, os animais vacinados com lipossomos não apresentaram estimulação de nenhum dos anticorpos específicos para P. multocida analisados. Os animais imunizados com EBS apresentaram um significativo aumento dos níveis de IgG sérico 7 dias após a imunização os quais se mantiveram constantes durante todo o período experimental. Os níveis de IgG no soro de animais imunizados com os proteolipossomos apresentam um aumento 7 dias após a imunização, porém não se mantiveram até o momento da infecção experimental. Após a infecção experimental, os níveis séricos de IgG nos animais imunizados com proteolipossomos apresentam um aumento significativo, enquanto que para os imunizados com EBS houve manutenção dos níveis antes obtidos. A análise de anticorpos IgM específicos para a P. multocida mostram uma produção significativamente maior destes anticorpos para animais imunizados previamente com proteolipossomos que para os animais imunizados com EBS. Além disso, após a infecção experimental, a produção de IgM nos animais imunizados com proteolipossomos continuou sendo estimulada, o que não foi observado para os animais imunizados com EBS. O sistema de proteolipossomos não produz anticorpos IgA sistêmicos específicos para a bactéria, porém após a infecção experimental foi possível observar o aparecimento gradativo deste anticorpo no lavado nasal dos animais, durante as semanas de observação. Os animais previamente imunizados com proteolipossomos sobreviventes da primeira infecção experimental foram observados durante 140 dias e novamente infectados, com nova carga bacteriana. Após a reinfecção a sobrevida destes animais foi de 100 % indicando que o sistema de proteolipossomos foi capaz de gerar uma memória imunológica. A análise conjunta dos resultados obtidos na detecção de anticorpos indica que a proteção proporcionada pelos proteolipossomos contra a pasteurelose é devida a estimulação de anticorpos IgG e, principalmente, de IgM. O outro sistema de delivery de proteínas antigênicas desenvolvido foi o de microesferas lipídicas. Foram experimentados diferentes protocolos, porém o que mais se adequou as nossas condições foi obtido da união e adaptação de duas metodologias descritas na literatura. Estudos de microscopia eletrônica de varredura mostraram que as microesferas lipídicas são formadas quando é utilizado 3 % (p/v) de PVA na formulação. Além disso, marcamos as proteínas com isoticiocianato de fluoresceína e a microscopia revelou a presença de estruturas esféricas fluorescentes, indicando a encapsulação das proteínas na região lipofílica das microesferas. Estudos sistemáticos variando a concentração de óleo, fosfolipídio, proteínas e PVA na formação das microcapsulas permitiram um rendimento de encapsulação de cerca de 99 %. Portanto, no presente trabalho, estabelecemos metodologias de incorporação das proteínas antigênicas em lipossomos constituídos de DPPC e em microesferas lipídicas. Além disso, os sistemas de proteolipossomos apresentaram uma satisfatória propriedade de proteção dos coelhos contra a pasteurelose (frente à infecção experimental com P. multocida) indicando que o sistema aqui proposto pode ser utilizado como vacina, prevenindo a pasteurelose em criações de coelhos comerciais ou destinados à pesquisa biomédica. / Pasteurellosis is a common disease in the respiratory tract of commercial and/or biomedical rearing of research rabbits. The bacterium Pasteurella multocida is the pathogen responsible for a range of clinical syntomes, including chronic rhinitis (snuffles), otitis media, pneumonia, genital infection, pulmonary and cutaneous abscesses, conjunctivitis and hemorrhagic septicemia. However, between 50 and 70 % of the animals can harbour the microorganism asymptomatically. The factors that cause the clinical syntomes include the ammonium accumulation in the air (foul ventilation), pregnancy, another concomitant disease, disorder in the rabbit production environment and experimental manipulation. Outbreaks of this disease occur in Brazil with relative frequency; however diagnosis is generally based on the clinical signals and necropsy. Therefore, it is difficult to estimate the extent of losses caused by pasteurellosis druing cuniculture. However, specific commercial vaccines against pasteurellosis in rabbits are not available and prevention is through the use of antibiotics in drinking water, even though this type of treatment generally does not protect the animals. Initially, pure bacteria colonies were obtained, which were cultivated in specific growing media (BHI). The microorganisms were isolated, lysed and the antigenic proteins were detected by SDS-PAGE and Western Blotting. These results show that most protein bands were recognized by the policlonal antibody against P. multocida. Since this protein pool presented antigenicity, the protein mixture was solubilized by incubating 0,5 mg/ml of the membrane fraction with SDS 1 % (w/v) under constant agitation for 2 hours. This procedure resulted in a 85 % solubilization yield. The proteoliposomes wew formed using a lipid, protein and detergent co-solubilization method. A good yield of protein incorporation in liposomes seems to be related to the methodology used for the removal of the detergent from the lipid:protein:detergent mixture during the co-solubilization process, as well as the nature of the phospholipid used. The results indicated that the Calbiosorb® resin was the most efficient for SDS removal and, among the various phospholipids tested, DPPC best incorporated the proteins, presenting an incorporation yield of 93% and average proteoliposome diameter of 180 nm. In addition, SDS-PAGE of the proteoliposomes has shown that all the proteic species present in the crude solubilized extract were incorporated in the DPPC liposomes. The Western Blotting has shown that the proteins incorporated in the liposomes continue to be recognized by the policlonal antibody against P. multocida. For the immunization assays, three animal groups were separated: (i) rabbits immunized with liposomes; (ii) rabbits immunized with crude solubilized extract (CSE) and (iii) rabbits immunized with the proteoliposomes. After twenty-one days of immunization with the described preparations, the animals were challenged with 105 ufc of bacteria. All animals previously vaccinated with the liposomes or CSE died while the animals vaccinated with the proteoliposomes systems had 95 % survival after the challenge. Moreover, a control group vaccinated with the attenuated bacteria in the presence of aluminum hydroxide as an immunoadjuvant had only 30% survival, indicating that the conventional vaccine does not protect against pasteurellosis. The serum of animals vaccinated with liposome, CSE and proteoliposomes were collected weekly before and after the experimental infection for the detection of IgG, IgM and IgA antibodies production using ELISA. Animals vaccinated with liposomes did not present stimulation of any of the specific antibodies for the P. multocida analyzed. The animals immunized with CSE presented a significant increase in the IgA serum level seven days after the immunization, but these levels were not maintained until the moment of the experimental infection. After the experimental infection, the serum levels of IgG in rabbits immunized with proteoliposomes showed a significant increase, while for those animals immunized with the CSE the levels were maintained. The analysis of IgM antibodies specific for the P. multocida showed a higher production to animals vaccinated with proteoliposomes than for the animals immunized with CSE. Furthermore, after experimental infection, the production of IgM in animals immunized with proteoliposomes continued to be stimulated, which was not observed for those immunized with EBS. The proteoliposome system does not induce IgA systemic antibodies that were specific for the bacterium. However, after the experimental infections it was possible to observe the gradual appearance of IgA in the nasal lavage of the infected animals on the time course of the experiment. Animals previously immunized with the proteoliposomes which survived the first experimental infection were observed during 140 days and re-infected. After the re-infection, the survival of these animals was 100 %, indicating that the proteoliposome system was able to generate a possible immunological memory. The global analysis of the results obtained in the antibody detection indicates that the protection given by the proteoliposome against pasteurellosis is due to the stimulation of antibodies IgG and mainly of IgM. The other delivery system of antigenic proteins developed during this work is of lipidic microspheres. Different protocols were tried, but the one which was more adequate to our experimental conditions was elaborated from joining and adapting two methodologies described in literature. Scanning electron microscopy studies have shown that the lipidic microspheres are formed when 3 % (w/v) of PVA is used in the formulation. Furthermore, we have marked the proteins with fluorescein isothiocyanate and the microscopy revealed the presence of fluorescent spherical structures which indicated the encapsulation of the proteins in the lipophilic region of the microspheres. Systematic studies varying the concentration of oil, phospholipid, proteins and PVA in the microcapsules formulation has given a yield of encapsulation of 99%. We have established methodologies of incorporation of the antigenic proteins in liposomes constituted of DPPC and lipidic microspheres. Moreover, the proteolipossome systems have shown a satisfying property of protection of rabbits against pasteurellosis in face of the experimental challenge with P. multocida indicating that the system proposed here can be used as a vaccine to prevent the pasteurellosis either in commercial or biomedical research rearing of rabbit.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-15122006-155356 |
| Date | 07 December 2004 |
| Creators | Daghastanli, Katia Regina Perez |
| Contributors | Ciancaglini, Pietro |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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