O presente trabalho visou a construção de uma linhagem recombinante de levedura que apresentasse a proteína MerR ancorada à sua superfície celular externa. Para tanto, foi realizada a fusão gênica do gene codificador de MerR de C. metallidurans, que apresenta elevada afinidade e seletividade para íons mercúrio, com a sequência codificadora da região C- terminal da proteína Flo1p, utilizado como âncora. A fusão gênica foi inserida entre as sequência codificadoras do promotor e terminador de transcrição do gene da fosfoglicerato quinase (PGK) do vetor de expressão de levedura pMA91, obtendo-se o plasmídeo recombinante pMA91MF. Esse plasmídeo foi empregado na transformação genética da linhagem de S. cerevisiae YPH252. A linhagem de S. cerevisiae recombinante YPH252/pMA91MF apresentou a proteína MerR ancorada na superfície celular e mostrou ter capacidade aumentada de ligar Hg2+ em relação à linhagem de levedura controle YPH252/pMA91. Portanto, foi confirmada a funcionalidade do sistema de ancoragem da proteína MerR à superfície celular de levedura aumentando a biossorção de mercúrio pela linhagem recombinante, com potencial para ser utilizada como uma ferramenta biotecnológica para a biorremediação de águas contaminadas com mercúrio. / This work describes the construction of recombinant yeast strain by anchoring MerR on the cell wall, using the C-terminal region of the Flo1 protein as an anchor. Therefore, several molecular cloning steps resulted in the inserting of gene fusion SS-merR-Flo428 (-factor signal sequence, coding sequence of MerR and C-terminal region of the Flo1 protein) into a yeast expression vector, pMA91, under control of the S. cerevisiae 3-phosphoglycerate kinase (PGK) promoter, the resulting plasmid was named pMA91MF. This plasmid carrying the anchoring and expression cassette MerR was used to transform the S. cerevisiae YPH252 strain. The transformants were selected by genetic complementation the Leu+ phenotype. The display of MerR on the cell surface of recombinant strain YPH252/pMA91MF was confirmed by transmission electron microscopy (TEM).After 10 min of incubation with 5.0 mM HgCl2, recombinant strain YPH252/pMA91MF adsorbed 109.6 mg Hg2+/g dry cell weight, 54% higher than the Hg2+ binding capacity of control strain YPH252/pMA91. After 10 min of incubation with 10.0 mM HgCl2, recombinant strain adsorbed 173.8 mg Hg2+g dry cell weight, 84% higher than the Hg2+ binding capacity of control strain (94.5 mg de Hg2+/g dry cell weight). The rapid initial adsorption of Hg2+ suggests an instantaneous binding of Hg2+ to MerR anchored on the cell surface of the recombinant yeast strain. It was observed that the binding rate to Hg2+ showed saturation with increasing external ion concentrations and reached saturation of HgCl2 in 15.0 mM after 120 min of incubation. Probably the input Hg2+ inside the cells affected cell function, but detoxification mechanisms are still active, protecting the cells from the toxic effect of Hg2+. The results confirm the construction of the recombinant strain YPH252/pMA91MF and functionality of the anchoring system for MerR on the yeast cell surface, increasing the mercury biosorption by recombinant yeast strain, with potential for use as a biotechnological tool for the bioremediation of contaminated water with mercury.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-12062013-102455 |
| Date | 01 March 2013 |
| Creators | Navarro, Jessica Paola Fuentes Rivera |
| Contributors | Vicente, Elisabete Jose |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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