O presente trabalho visou a construção de uma linhagem recombinante de levedura que apresentasse a proteína MerR ancorada à sua superfície celular externa. Para tanto, foi realizada a fusão gênica do gene codificador de MerR de C. metallidurans, que apresenta elevada afinidade e seletividade para íons mercúrio, com a sequência codificadora da região C- terminal da proteína Flo1p, utilizado como âncora. A fusão gênica foi inserida entre as sequência codificadoras do promotor e terminador de transcrição do gene da fosfoglicerato quinase (PGK) do vetor de expressão de levedura pMA91, obtendo-se o plasmídeo recombinante pMA91MF. Esse plasmídeo foi empregado na transformação genética da linhagem de S. cerevisiae YPH252. A linhagem de S. cerevisiae recombinante YPH252/pMA91MF apresentou a proteína MerR ancorada na superfície celular e mostrou ter capacidade aumentada de ligar Hg2+ em relação à linhagem de levedura controle YPH252/pMA91. Portanto, foi confirmada a funcionalidade do sistema de ancoragem da proteína MerR à superfície celular de levedura aumentando a biossorção de mercúrio pela linhagem recombinante, com potencial para ser utilizada como uma ferramenta biotecnológica para a biorremediação de águas contaminadas com mercúrio. / This work describes the construction of recombinant yeast strain by anchoring MerR on the cell wall, using the C-terminal region of the Flo1 protein as an anchor. Therefore, several molecular cloning steps resulted in the inserting of gene fusion SS-merR-Flo428 (-factor signal sequence, coding sequence of MerR and C-terminal region of the Flo1 protein) into a yeast expression vector, pMA91, under control of the S. cerevisiae 3-phosphoglycerate kinase (PGK) promoter, the resulting plasmid was named pMA91MF. This plasmid carrying the anchoring and expression cassette MerR was used to transform the S. cerevisiae YPH252 strain. The transformants were selected by genetic complementation the Leu+ phenotype. The display of MerR on the cell surface of recombinant strain YPH252/pMA91MF was confirmed by transmission electron microscopy (TEM).After 10 min of incubation with 5.0 mM HgCl2, recombinant strain YPH252/pMA91MF adsorbed 109.6 mg Hg2+/g dry cell weight, 54% higher than the Hg2+ binding capacity of control strain YPH252/pMA91. After 10 min of incubation with 10.0 mM HgCl2, recombinant strain adsorbed 173.8 mg Hg2+g dry cell weight, 84% higher than the Hg2+ binding capacity of control strain (94.5 mg de Hg2+/g dry cell weight). The rapid initial adsorption of Hg2+ suggests an instantaneous binding of Hg2+ to MerR anchored on the cell surface of the recombinant yeast strain. It was observed that the binding rate to Hg2+ showed saturation with increasing external ion concentrations and reached saturation of HgCl2 in 15.0 mM after 120 min of incubation. Probably the input Hg2+ inside the cells affected cell function, but detoxification mechanisms are still active, protecting the cells from the toxic effect of Hg2+. The results confirm the construction of the recombinant strain YPH252/pMA91MF and functionality of the anchoring system for MerR on the yeast cell surface, increasing the mercury biosorption by recombinant yeast strain, with potential for use as a biotechnological tool for the bioremediation of contaminated water with mercury.

O presente trabalho visou a construção de uma linhagem recombinante de levedura que apresentasse a proteína MerR ancorada à sua superfície celular externa. Para tanto, foi realizada a fusão gênica do gene codificador de MerR de C. metallidurans, que apresenta elevada afinidade e seletividade para íons mercúrio, com a sequência codificadora da região C- terminal da proteína Flo1p, utilizado como âncora. A fusão gênica foi inserida entre as sequência codificadoras do promotor e terminador de transcrição do gene da fosfoglicerato quinase (PGK) do vetor de expressão de levedura pMA91, obtendo-se o plasmídeo recombinante pMA91MF. Esse plasmídeo foi empregado na transformação genética da linhagem de S. cerevisiae YPH252. A linhagem de S. cerevisiae recombinante YPH252/pMA91MF apresentou a proteína MerR ancorada na superfície celular e mostrou ter capacidade aumentada de ligar Hg2+ em relação à linhagem de levedura controle YPH252/pMA91. Portanto, foi confirmada a funcionalidade do sistema de ancoragem da proteína MerR à superfície celular de levedura aumentando a biossorção de mercúrio pela linhagem recombinante, com potencial para ser utilizada como uma ferramenta biotecnológica para a biorremediação de águas contaminadas com mercúrio. / This work describes the construction of recombinant yeast strain by anchoring MerR on the cell wall, using the C-terminal region of the Flo1 protein as an anchor. Therefore, several molecular cloning steps resulted in the inserting of gene fusion SS-merR-Flo428 (-factor signal sequence, coding sequence of MerR and C-terminal region of the Flo1 protein) into a yeast expression vector, pMA91, under control of the S. cerevisiae 3-phosphoglycerate kinase (PGK) promoter, the resulting plasmid was named pMA91MF. This plasmid carrying the anchoring and expression cassette MerR was used to transform the S. cerevisiae YPH252 strain. The transformants were selected by genetic complementation the Leu+ phenotype. The display of MerR on the cell surface of recombinant strain YPH252/pMA91MF was confirmed by transmission electron microscopy (TEM).After 10 min of incubation with 5.0 mM HgCl2, recombinant strain YPH252/pMA91MF adsorbed 109.6 mg Hg2+/g dry cell weight, 54% higher than the Hg2+ binding capacity of control strain YPH252/pMA91. After 10 min of incubation with 10.0 mM HgCl2, recombinant strain adsorbed 173.8 mg Hg2+g dry cell weight, 84% higher than the Hg2+ binding capacity of control strain (94.5 mg de Hg2+/g dry cell weight). The rapid initial adsorption of Hg2+ suggests an instantaneous binding of Hg2+ to MerR anchored on the cell surface of the recombinant yeast strain. It was observed that the binding rate to Hg2+ showed saturation with increasing external ion concentrations and reached saturation of HgCl2 in 15.0 mM after 120 min of incubation. Probably the input Hg2+ inside the cells affected cell function, but detoxification mechanisms are still active, protecting the cells from the toxic effect of Hg2+. The results confirm the construction of the recombinant strain YPH252/pMA91MF and functionality of the anchoring system for MerR on the yeast cell surface, increasing the mercury biosorption by recombinant yeast strain, with potential for use as a biotechnological tool for the bioremediation of contaminated water with mercury.

Este trabalho descreve a construção de plasmídeos para expressão e ancoragem de proteínas de alta afinidade a íons Hg2+ e As5+. Os genes merR e arsR de C. metallidurans foram inseridos no vetor que contém o sistema para expressão e ancoragem de proteínas heterólogas em bactérias Gram-negativas originando os plasmídeos pCM-Hg e pCM-As. MerR e ArsR foram produzidas sob comando do promotor pan. E. coli recombinantes apresentaram resistência 100% superior a Hg2+ e As5+. C. metallidurans/pCM-As apresentou MIC > Na3As02 1000 mM sendo a Gram-negativa com maior capacidade de sobrevivência a íons As5+. Os plasmídeos elevaram a sobrevivência das bactérias estudadas, podendo ser usados para aumentar índices de sobrevivência e fornecer viabilidade a outras cepas. Células recombinantes apresentaram capacidade de adsorver Hg2+ ou As5+ do meio em níveis superiores às linhagens selvagens. As bactérias descritas são excelentes candidatas para biorremediação. Este trabalho apresenta pela primeira vez a ancoragem da proteína ArsR na superfície celular de um micro-organismo. / This work describes the construction of plasmids for expression and anchoring of high affinity proteins to Hg2+ or As5+ ions. C. metallidurans merR and arsR genes were inserted into the vector which contains the system for expression and anchoring of heterologous proteins in Gram-negative bacterias origining the plasmids pCM-Hg and pCM-As. MerR and ArsR were produced under pan promoter command. Recombinant E. coli showed resistance 100% higher to Hg2+ and As5+. C. metallidurans/pCM-As showed MIC > Na3As02 1000 mM being the most resistance Gram-negative able to survive in As5+ sites. The plasmids increased the studied Gram-negatives bacterial surviving and they can be utilized in other strains to increase the surviving levels and supply viability. Recombinant cells showed ability for adsorption of Hg2+ or As5+ from the media in enhanced levels as compared to the wild type. The described bacterias are excellent candidates for bioremediation. This work presents for the first time the cell surface display of ArsR protein on a microorganism.

Made available in DSpace on 2015-04-22T22:01:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Wamber Boni de Souza.pdf: 2659314 bytes, checksum: 7f9a2f165e36496d3cc87db36897ea3e (MD5) Previous issue date: 2013-06-03 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas / This work describes the mercury and a summary on toxicity of organomercury, as well as environmental importance of the HS, addressing structural aspects of the interaction between carboxylic groups from humic and fulvic acids and Hg, in two reviews. A third review is presented the Density Functional Theory (DFT) applied to theoretical study of mercury and its compounds. Environmental chemistry of Hg is extensively revised, especially the reduction process Hg2+  Hg+  Hg0. The Hg can also be found in forms organomercury, which the methylmercury (methyl-Hg, CH3Hg+) and dimethylmercury (dimethyl-Hg, CH3(Hg)2) are the most important. Structurally, the difference between the two forms of Hg is the number of methyl groups. Important tool in the consolidation of experimental data, theoretical calculations have proven that they are capable of complementing experimental results. The DFT B3LYP functional with LANL2DZ basis set are performed for the neutral structures dimethylmercury (Dimetil-Hg), methylmercury (MetHgCl), methylmercury bromide (MetHgBr), methylmercury iodide (MetHgI) and charged methylmercury (Met-Hg), methylmercury oxide ion (MetHgO-), methylmercury sulfide ion (METHgS-), methylmercury selenide ion (MetHgSe-). Additionally, the interaction of the Model of Humic Substance Molecules (MHSM) (Benzoic acid (AB), Phthalic acid (AFT), Salicylic acid (AS) e 2,4-dihydroxybenzoic acid (2,4-ADHBC) and carboxylic groups from fulvic acid (AFRS) structure proposed for the Suwannee River with Hg2+ has been investigated theoretically by using DFT method with high level B3LYP/ LANL2DZ model in order to contribute to the understanding of the behavior of Hg in nature. Findings show that the structure of methyl-Hg is more stable and less reactive than dimethyl-Hg. The bond lengths C-Hg on Met-Hg-X (X = Cl-, Br- and I-) increase with increasing volume. In the case of Met-Hg-X (X = O2-, S2- and Se2-), the bond length C-Hg remains virtually unchanged. The charge distribution analysis has revealed that the Hg oxidation tendency to reduce or anion depending on what is on. The trend of reduction/oxidation is accompanied by a greater stabilization energy (NBO) and ΔEL. The HUMO-LUMO orbital shows the structures Met-Hg-X (X = Cl-, Br- and I-) that has a larger Δε Met-Hg-X (X = O2-, S2- and Se2-). Finally, the use of B3LYP/LANL2DZ shows errors in bond length in relation to the experimental data varying between 4.74 and 6.43%. The results showed that the interaction between the carboxylic acid and Hg2+ ions indicate the occurrence of a reduction process rather than complexation in the MMSH. The interaction AB Hg ions formed with the carboxylic AB proved to be the most stable among all the MMSH-Hg. The highest values of stabilization energy of second order were observed by the molecules AB Hg e AFT Hg. Findings showed that the complexation and reduction depends on the location of the carboxyl groups in the structure of fulvic acid in the AFRS. Furthermore, the binding energy, geometry and energy gap is altered by interaction with the carboxylic groups of AFRS with Hg2+. / Esta tese descreve o mercúrio e um resumo sobre a toxicidade dos compostos organomercuriais, bem como a importância ambiental da SH, abordando aspectos estruturais da interação entre grupos carboxílicos dos ácidos húmicos e fúlvicos e Hg, em duas revisões. A terceira revisão é apresentada a Teoria do Funcional da Densidade (DFT) aplicada ao estudo teórico de mercúrio e seus compostos. A química ambiental do Hg é revista extensivamente, especialmente o processo de redução do Hg2+  Hg+  Hg0. O Hg pode ser encontrado também em formas organomercurais, das quais o metilmercúrio (metil-Hg, CH3Hg+) e dimetil-Hg (dimetil-Hg CH3(Hg)2) são as mais importantes. Estruturalmente a diferença entre as duas formas de Hg é a quantidade de grupos metilas. Ferramenta importante na consolidação de dados experimentais, os cálculos teóricos já comprovaram que são capazes de complementar resultados experimentais. A DFT e o funcional B3LYP com o conjunto de base LANL2DZ foram usados para a otimizações de geometria para as estruturas neutras dimetilmercúrio (Dimetil-Hg), cloreto de metilmercúrio (MetHgCl), brometo de metilmercúrio (MetHgBr), Iodeto de metilmercúrio (MetHgI) e carregadas metilmercúrio (Met-Hg), íon óxido de metilmercúrio(MetHgO-), íon sulfeto de metilmercúrio (METHgS-) e íon seleneto de metilmercúrio (MetHgSe-). Além disso, a interação dos grupos carboxílicos de moléculas modelos de substâncias húmicas (MMSH), (Ácido benzoico (AB), Ácido ftálico (AFT), ácido salicílico (AS) e ácido 2,4-diidroxibenzocarboxílico) e de ácido fúlvico (AFRS) de estrutura proposta do rio Suwannee com Hg2+ foi investigado teoricamente por DFT no nível de cálculos B3LYP/LANL2DZ, a fim de contribuir para o entendimento do comportamento do mercúrio na natureza. Os resultados mostram que a estrutura do metil-Hg é mais reativa e menos estável que a estrutura do dimetil-Hg. Os comprimentos de ligação C Hg no Met-Hg-X (X = Cl-, Br- e I-) aumentam com o aumento do volume. No caso do Met-Hg-X- (X = O2-, S2- e Se2-) o comprimento de ligação C Hg permanece praticamente inalterado. A análise de distribuição de carga revelou que o Hg apresenta tendência para redução ou oxidação dependendo do ânion que está ligado. A tendência de redução/oxidação é acompanhada por uma maior energia de estabilização (NBO) e ΔEL. Os orbitais HOMO-LUMO mostram que as estruturas Met-Hg-X (X = Cl-, Br- e I-) possuem maior Δε que Met-Hg-X- (X = O2-, S2- e Se2- ). Finalmente o uso do B3LYP/LANL2DZ apresentou erros nos comprimento de ligação em relação aos dados experimentais variando entre 4,74 e 6,43%. Para as MMSH os resultados mostraram de modo geral, que a interação entre os íons carboxílicos e Hg2+ indicam a ocorrência de um processo de redução ao invés de complexação. Entre todas as MMSH-Hg, a interação AB Hg formada com os íons carboxílicos da AB mostrou ser a mais estável. As moléculas AB Hg e AFT Hg possuem os maiores valores de energia de estabilização de segunda ordem. Especificamente para os AFRS, os resultados indicam que a complexação e redução dependem da localização dos grupos carboxílicos na estrutura de ácido fúlvico. Além disso, a energia de ligação, a geometria

Este trabalho descreve a construção de plasmídeos para expressão e ancoragem de proteínas de alta afinidade a íons Hg2+ e As5+. Os genes merR e arsR de C. metallidurans foram inseridos no vetor que contém o sistema para expressão e ancoragem de proteínas heterólogas em bactérias Gram-negativas originando os plasmídeos pCM-Hg e pCM-As. MerR e ArsR foram produzidas sob comando do promotor pan. E. coli recombinantes apresentaram resistência 100% superior a Hg2+ e As5+. C. metallidurans/pCM-As apresentou MIC > Na3As02 1000 mM sendo a Gram-negativa com maior capacidade de sobrevivência a íons As5+. Os plasmídeos elevaram a sobrevivência das bactérias estudadas, podendo ser usados para aumentar índices de sobrevivência e fornecer viabilidade a outras cepas. Células recombinantes apresentaram capacidade de adsorver Hg2+ ou As5+ do meio em níveis superiores às linhagens selvagens. As bactérias descritas são excelentes candidatas para biorremediação. Este trabalho apresenta pela primeira vez a ancoragem da proteína ArsR na superfície celular de um micro-organismo. / This work describes the construction of plasmids for expression and anchoring of high affinity proteins to Hg2+ or As5+ ions. C. metallidurans merR and arsR genes were inserted into the vector which contains the system for expression and anchoring of heterologous proteins in Gram-negative bacterias origining the plasmids pCM-Hg and pCM-As. MerR and ArsR were produced under pan promoter command. Recombinant E. coli showed resistance 100% higher to Hg2+ and As5+. C. metallidurans/pCM-As showed MIC > Na3As02 1000 mM being the most resistance Gram-negative able to survive in As5+ sites. The plasmids increased the studied Gram-negatives bacterial surviving and they can be utilized in other strains to increase the surviving levels and supply viability. Recombinant cells showed ability for adsorption of Hg2+ or As5+ from the media in enhanced levels as compared to the wild type. The described bacterias are excellent candidates for bioremediation. This work presents for the first time the cell surface display of ArsR protein on a microorganism.