O objetivo desse estudo foi investigar a participação de integrina α1β1 e microRNAs (miRs) no potencial osteogênico de superfícies de titânio (Ti) com nanotopografia. Discos de Ti previamente polidos foram tratados quimicamente com H2SO4/H2O2 para obtenção de nanotopografia, que foi observada por microscopia eletrônica de varredura. Para o estudo da participação da integrina α1β1, células-tronco mesenquimais (CTMs) de ratos foram cultivadas em condições osteogênicas e não osteogênicas sobre superfícies de Ti com nanotopografia e sem tratamento químico (controle). O resultados mostraram que a nanotopografia de Ti aumentou a proliferação celular, a atividade de fosfatase alcalina (Alp) e regulou positivamente a expressão gênica de marcadores da diferenciação osteoblástica em CTMs cultivadas tanto em condições osteogênicas quanto em condições não osteogênicas. Além disso, uma maior expressão gênica para as integrinas α1 e β1 foi observada em culturas crescidas sobre nanotopografia em condições não osteogênicas em relação ao Ti controle. O uso de obtustatina, um inibidor de integrina α1β1, reduziu os efeitos da nanotopografia sobre os marcadores osteoblásticos, indicando a participação da via de sinalização dessa integrina nos efeitos da nanotopografia sobre CTMs. Para investigar a participação de miRs no efeito osseoindutor da nanotopografia de Ti, foram utilizadas CTMs humanas e células préosteoblásticas de camundongos da linhagem MC3T3-E1. A análise em larga escala da expressão de miRs revelou que 60 miRs foram regulados positivamente (no mínimo, 2x maior), enquanto 58 miRs foram regulados negativamente (no mínimo, 2x menor) em CTMs crescidas sobre a nanotopografia. Três desses miRs, miR-4448, -4708 e -4773, cuja expressão foi significativamente reduzida pela nanotopografia de Ti (no mínimo, 5x menor), afetaram a diferenciação osteoblástica de CTMs. Esses miRs atuam diretamente sobre SMAD1 e SMAD4, proteínas transdutoras da sinalização da proteína óssea morfogenética 2 (Bmp-2), conhecida por sua capacidade osseoindutora. Além disso, verificou-se que a sobreexpressão de miR-4448, -4708 e -4773 em células pré-osteoblásticas MC3T3-E1 inibiu a expressão gênica e proteica de SMAD1 e SMAD4 e, consequentemente, a expressão gênica de marcadores ósseos. Esses dados sugerem a influência do circuito miR-SMAD-Bmp-2 sobre o efeito osseoindutor da nanotopografia. Conjuntamente, os achados do presente estudo mostraram que o efeito da nanotopografia de Ti sobre a diferenciação osteoblástica resulta de um mecanismo regulatório complexo, do qual fazem parte as vias de sinalização da integrina α1β1 e da Bmp-2, com a participação de miRs. Esses resultados podem representar um avanço para o desenvolvimento de novas modificações de superfície, com o objetivo de acelerar e/ou melhorar o processo de osseointegração. / The aim of this study was to investigate the role of the α1β1 integrin and microRNAs (miRs) on the osteogenic potential of titanium (Ti) with nanotopography. Polished Ti discs were chemically treated with H2SO4/H2O2 to generate nanotopography, which was observed under scanning electron microscopy. For the study related to the α1β1 integrin, rat mesenchymal stem cells (MSCs) were cultured under osteogenic and non-osteogenic conditions on Ti with nanotopography and non-treated Ti discs (control). Nanotopography increased cell proliferation and alkaline phosphatase (Alp) activity and upregulated the gene expression of bone markers in cells cultured under osteogenic and non-osteogenic conditions. Furthermore, the gene expression of α1 and β1 integrins was higher in cells cultured on nanotopography under non-osteogenic conditions compared with control. Obtustatin, an inhibitor of α1β1 integrin, reduced the higher gene expression of the bone markers induced by nanotopography. These results indicate that α1β1 integrin signaling pathway determines the osteoinductive effect of nanotopography on MSCs. The role of miRs in the osteogenic potential of Ti with nanotopography was evaluated using human MSCs and MC3T3-E1 mouse pre-osteoblastic cells. The miR sequencing analysis revealed that 60 miRs were upregulated (> 2 fold), while 58 miRs were downregulated (< 2 fold) in MSCs grown on nanotopography. Three miRs, miR-4448, -4708 and -4773, which were significantly downregulated (< 5 fold) by nanotopography, affected the osteoblast differentiation of MSCs. These miRs directly target SMAD1 and SMAD4, both key transducers of the bone morphogenetic protein 2 (Bmp-2) osteogenic signal, which were upregulated by nanotopography. Overexpression of miR-4448 - 4708 and 4773 in MC3T3-E1 cells noticeably inhibited gene and protein expression of SMAD1 and SMAD4 and by targeting them, these miRs repressed gene expression of key bone markers. These results suggest that a miR-SMAD-Bmp-2 circuit acts in the Ti nanotopography-mediated osteoblast differentiation. Taken together, our data showed that the osteoblast differentiation induced by Ti with nanotopography is governed by a complex regulatory network involving a crosstalk between α1β1 integrin and Bmp-2 signaling pathways with participation of miRs.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-13052014-113622 |
| Date | 25 April 2014 |
| Creators | Kato, Rogério Bentes |
| Contributors | Beloti, Márcio Mateus |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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