Em Implantodontia, o titânio (Ti) é o material de escolha para a confecção dos implantes dentários por apresentar excelentes propriedades mecânicas e biocompatibilidade. Entretanto, novas estratégias de modificações da topografia e da composição bioquímica da superfície de Ti vêm sendo pesquisadas com o objetivo de incrementar a biocompatibilidade do Ti. A combinação de alterações topográficas em escala nanométrica e revestimento com o colágeno tipo I seria uma modificação com potencial para aumentar e/ou acelerar o processo de osseointegração. Assim, o objetivo desse estudo foi avaliar o efeito de superfície de Ti com nanotopografia revestida com colágeno sobre a osteogênese in vitro. Para isso, osteoblastos derivados de calvária de ratos foram cultivados em meio osteogênico sobre 4 superfícies de Ti: usinada (Ti Usi), usinada revestida com colágeno (Ti Usi/Col), com nanotopografia (Ti Nano) e com nanotopografia revestida com colágeno (Ti Nano/Col). A osteogênese foi avaliada pelos seguintes parâmetros: viabilidade celular; expressão das proteínas sialoproteína óssea (BSP) e osteopontina (OPN); atividade de fosfatase alcalina (ALP); expressão dos genes ALP, colágeno tipo I (COL), osteocalcina (OC), OPN, osterix (OSX) e runt-related transcription factor 2 (RUNX-2); e a formação de matriz extracelular mineralizada. Os dados foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguido pelo pós-teste Student- Newman-Keuls e o nível de significância adotado foi de 5%. Aos 7 dias, a viabilidade celular foi maior sobre a superfície Ti Nano/Col, comparada às outras superfícies, dentre as quais não foi detectada diferença estatisticamente significante. Houve um 11 aumento da atividade da ALP dos 7 para os 10 dias; aos 7 dias, a atividade da ALP foi menor na superfície Ti Usi em comparação às superfícies Ti Nano e Ti Nano/Col; e aos 10 dias a atividade da ALP foi maior nas células crescidas sobre a superfície Ti Nano/Col comparado às demais superfícies. A imunolocalização, tanto para a OPN aos 3 dias quanto para BSP aos 7 e 10 dias, foi maior nos grupos Ti Nano e Ti Nano/Col com marcações fortes por todo o citoplasma além de depósitos extracelulares adjacentes às células. A expressão dos genes marcadores osteoblásticos avaliados foi maior sobre as superfícies Ti Nano e Ti Nano/Col, em comparação com as superfícies Ti Usi e Ti Usi/Col. A formação de matriz mineralizada foi maior nas superfícies Ti Usi/Col e Ti Nano/Col em relação às superfícies Ti Usi e Ti Nano, dentre as quais não foi detectada diferença estatisticamente significante. Esses resultados sugerem que a combinação de nanotopografia com revestimento com colágeno de superfícies de Ti estimula os eventos intermediários da osteogênese e tem potencial para favorecer a osseointegração dos implantes de Ti. / In Implantology, titanium (Ti) is the material of choice for the manufacture of dental implants because of its excellent mechanical properties and biocompatibility. However, new strategies to modify the topography and biochemical composition of Ti surfaces have been tested in order to increase the biocompatibility of Ti. The combination of topographic changes at the nanoscale and coating with collagen type I has potential to increase and/or accelerate the osseointegration process. The aim of this study was to evaluate the effect of Ti surface with nanotopography coated with collagen on in vitro osteogenesis. For this, osteoblasts harvested from rat calvaria were cultured in osteogenic medium on 4 Ti surfaces: machined (Ti Usi), machined coated with collagen (Ti Usi/Col), nanotopography (Ti Nano) and nanotopography coated with collagen (Ti Nano/Col). The osteogenesis was evaluated using the following parameters: cell viability; expression of bone sialoprotein protein (BSP) and osteopontin (OPN); Alkaline phosphatase (ALP) activity; gene expression of ALP, type I collagen (COL), osteocalcin (OC), OPN, osterix (OSX) and runt-related transcription factor 2 (RUNX-2); and the formation of mineralized extracellular matrix. Data were compared by analysis of variance (ANOVA) followed by Student-Newman-Keuls post-test and the significance level was set at 5%. At 7 days, cell viability was higher on the Ti Nano/Col compared 13 to other surfaces, among which was not detected statistically significant differences. There was an increase in ALP activity from 7 to 10 days; at 7 days, the activity of ALP was lower in Ti Usi surface compared to Ti Nano and Ti Nano/Col surfaces; and at 10 days the activity of ALP was higher in cells grown on the Ti Nano/Col surface compared to other surfaces. The immunolocalization to both OPN at 3 days and BSP at 7 and 10 days was higher in Ti Nano and Ti Nano/Col surfaces with strong labeling throughout the cytoplasm as well as extracellular deposits. The expression of the osteoblast marker genes was higher on Ti Nano and Ti Nano/Col surfaces compared to Ti Usi and Ti Usi/Col surfaces. The formation of mineralized matrix was higher in Ti Usi/Col and Ti Nano/Col surfaces than in Ti Usi and Ti Nano between which there was no statistically significant difference. These results suggest that the combination of nanotopography with collagen in Ti surfaces stimulates the intermediate events of the in vitro osteogenesis and seems to have potential to promote osseointegration of Ti implants.

Em Implantodontia, o titânio (Ti) é o material de escolha para a confecção dos implantes dentários por apresentar excelentes propriedades mecânicas e biocompatibilidade. Entretanto, novas estratégias de modificações da topografia e da composição bioquímica da superfície de Ti vêm sendo pesquisadas com o objetivo de incrementar a biocompatibilidade do Ti. A combinação de alterações topográficas em escala nanométrica e revestimento com o colágeno tipo I seria uma modificação com potencial para aumentar e/ou acelerar o processo de osseointegração. Assim, o objetivo desse estudo foi avaliar o efeito de superfície de Ti com nanotopografia revestida com colágeno sobre a osteogênese in vitro. Para isso, osteoblastos derivados de calvária de ratos foram cultivados em meio osteogênico sobre 4 superfícies de Ti: usinada (Ti Usi), usinada revestida com colágeno (Ti Usi/Col), com nanotopografia (Ti Nano) e com nanotopografia revestida com colágeno (Ti Nano/Col). A osteogênese foi avaliada pelos seguintes parâmetros: viabilidade celular; expressão das proteínas sialoproteína óssea (BSP) e osteopontina (OPN); atividade de fosfatase alcalina (ALP); expressão dos genes ALP, colágeno tipo I (COL), osteocalcina (OC), OPN, osterix (OSX) e runt-related transcription factor 2 (RUNX-2); e a formação de matriz extracelular mineralizada. Os dados foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguido pelo pós-teste Student- Newman-Keuls e o nível de significância adotado foi de 5%. Aos 7 dias, a viabilidade celular foi maior sobre a superfície Ti Nano/Col, comparada às outras superfícies, dentre as quais não foi detectada diferença estatisticamente significante. Houve um 11 aumento da atividade da ALP dos 7 para os 10 dias; aos 7 dias, a atividade da ALP foi menor na superfície Ti Usi em comparação às superfícies Ti Nano e Ti Nano/Col; e aos 10 dias a atividade da ALP foi maior nas células crescidas sobre a superfície Ti Nano/Col comparado às demais superfícies. A imunolocalização, tanto para a OPN aos 3 dias quanto para BSP aos 7 e 10 dias, foi maior nos grupos Ti Nano e Ti Nano/Col com marcações fortes por todo o citoplasma além de depósitos extracelulares adjacentes às células. A expressão dos genes marcadores osteoblásticos avaliados foi maior sobre as superfícies Ti Nano e Ti Nano/Col, em comparação com as superfícies Ti Usi e Ti Usi/Col. A formação de matriz mineralizada foi maior nas superfícies Ti Usi/Col e Ti Nano/Col em relação às superfícies Ti Usi e Ti Nano, dentre as quais não foi detectada diferença estatisticamente significante. Esses resultados sugerem que a combinação de nanotopografia com revestimento com colágeno de superfícies de Ti estimula os eventos intermediários da osteogênese e tem potencial para favorecer a osseointegração dos implantes de Ti. / In Implantology, titanium (Ti) is the material of choice for the manufacture of dental implants because of its excellent mechanical properties and biocompatibility. However, new strategies to modify the topography and biochemical composition of Ti surfaces have been tested in order to increase the biocompatibility of Ti. The combination of topographic changes at the nanoscale and coating with collagen type I has potential to increase and/or accelerate the osseointegration process. The aim of this study was to evaluate the effect of Ti surface with nanotopography coated with collagen on in vitro osteogenesis. For this, osteoblasts harvested from rat calvaria were cultured in osteogenic medium on 4 Ti surfaces: machined (Ti Usi), machined coated with collagen (Ti Usi/Col), nanotopography (Ti Nano) and nanotopography coated with collagen (Ti Nano/Col). The osteogenesis was evaluated using the following parameters: cell viability; expression of bone sialoprotein protein (BSP) and osteopontin (OPN); Alkaline phosphatase (ALP) activity; gene expression of ALP, type I collagen (COL), osteocalcin (OC), OPN, osterix (OSX) and runt-related transcription factor 2 (RUNX-2); and the formation of mineralized extracellular matrix. Data were compared by analysis of variance (ANOVA) followed by Student-Newman-Keuls post-test and the significance level was set at 5%. At 7 days, cell viability was higher on the Ti Nano/Col compared 13 to other surfaces, among which was not detected statistically significant differences. There was an increase in ALP activity from 7 to 10 days; at 7 days, the activity of ALP was lower in Ti Usi surface compared to Ti Nano and Ti Nano/Col surfaces; and at 10 days the activity of ALP was higher in cells grown on the Ti Nano/Col surface compared to other surfaces. The immunolocalization to both OPN at 3 days and BSP at 7 and 10 days was higher in Ti Nano and Ti Nano/Col surfaces with strong labeling throughout the cytoplasm as well as extracellular deposits. The expression of the osteoblast marker genes was higher on Ti Nano and Ti Nano/Col surfaces compared to Ti Usi and Ti Usi/Col surfaces. The formation of mineralized matrix was higher in Ti Usi/Col and Ti Nano/Col surfaces than in Ti Usi and Ti Nano between which there was no statistically significant difference. These results suggest that the combination of nanotopography with collagen in Ti surfaces stimulates the intermediate events of the in vitro osteogenesis and seems to have potential to promote osseointegration of Ti implants.

As integrinas constituem uma família de receptores de membrana que tem como função primária a adesão de células a proteínas da matriz extracelular e alguns de seus membros estão envolvidos nos processos de diferenciação osteoblástica e formação óssea, eventos diretamente relacionados à osseointegração de implantes de titânio (Ti). Sabe-se que superfícies de Ti com nano e microtopografia podem favorecer a diferenciação osteoblástica e a mineralização da matriz extracelular. No entanto, os mecanismos celulares envolvidos nesses processos não são completamente entendidos. Neste contexto, os objetivos deste estudo foram: (1) caracterizar as superfícies de Ti com nano (Ti-Nano) e microtopografia (Ti-Micro), (2) investigar a participação da integrina V na diferenciação osteoblástica induzida pelo Ti-Nano e (3) investigar a participação da integrina β3 na diferenciação osteoblástica induzida por Ti-Nano e Ti-Micro. Para isso, discos de Ti-Nano e Ti-Micro foram preparados por ataque ácido com H2SO4/H2O2 ou com HNO3/H2SO4 / HCl, respectivamente, e caracterizados quanto à topografia, rugosidade e composição química de superfície. Discos de Ti usinados foram usados com controle (Ti-Controle) em alguns experimentos. Células-tronco mesenquimais derivadas de medula óssea de ratos foram cultivadas sobre as três superfícies de Ti e foi avaliada a expressão gênica de componentes envolvidos na via de sinalização das integrinas por PCR array. Com base nos resultados do PCR array, as integrinas αV e β3 foram selecionadas e silenciadas por RNA de interferência (shRNA) ou CRISPR/Cas9, respectivamente, em células pré-osteoblásticas da linhagem MC3T3-E1 para investigarmos a participação dessas integrinas na diferenciação osteoblástica induzida por superfícies de Ti com diferentes topografias. Os resultados deste estudo mostraram que os tratamentos empregados foram eficientes para a produção de superfícies de Ti com topografias nas escalas nano e micrométrica. Além disso, foi demonstrado que o maior potencial osteogênico do Ti-Nano se deve, ao menos em parte, à integrina αV, uma vez que seu silenciamento reduziu a diferenciação osteoblástica induzida pela nanotopografia. Por fim, também demonstramos que a via de sinalização ativada pela integrina β3 exerce um papel fundamental no potencial osteogênico do Ti-Nano, mas não do Ti-Micro. O silenciamento da integrina β3 reduziu a diferenciação osteoblástica, concomitantemente com a regulação negativa da expressão de vários componentes das vias de sinalização de Wnt e de BMP, apenas nas células crescidas sobre a nanotopografia. Em conjunto, nossos resultados revelam um novo mecanismo para explicar a maior diferenciação osteoblástica induzida pelo Ti-Nano, que envolve uma complexa rede regulatória ativada pela maior expressão das integrinas αV e β3, esta última gerando ativação da transdução de sinal das vias de Wnt e de BMP / Integrins are a family of membrane receptors that primarily mediate cell adhesion to extracellular matrix proteins and some members are involved in the process of osteoblast differentiation and bone formation, key events of titanium (Ti) implant osseointegration. It is well known that Ti surfaces with nano and microtopography may favor osteoblast differentiation and matrix mineralization. However, the cellular mechanisms involved in this process are not entirely understood. In this context, the aims of this study were: (1) to characterize the Ti surfaces with nano (Ti-Nano) and microtopography (Ti-Micro), (2) to investigate the participation of integrin V on osteoblast differentiation induced by Ti-Nano and (3) to investigate the participation of integrin β3 on osteoblast differentiation induced by Ti-Nano and Ti-Micro. Discs of Ti-Nano and Ti-Micro were prepared with acid etching with H2SO4/H2O2 or with HNO3/H2SO4 / HCl, respectively, and characterized in terms of surface topography, roughness and chemical composition. Machined Ti discs (untreated) were used as control (Ti-Control) in some experiments. Mesenchymal stem cells from rat bone marrow were cultured on Ti discs with the three different surfaces and the gene expression of members of the integrin signaling pathway was evaluated by PCR array. Based on PCR array results, the integrins αV and β3 were selected and silenced using RNA interference (shRNA) or CRISPR-Cas9, respectively, in pre-osteoblastic cell line MC3T3-E1 to investigate the participation of these integrins in osteoblast differentiation induced by Ti with different surface topographies. The results showed that the treatments used were efficient to generate Ti surfaces with topographies at the nano and micrometric scales. We showed that the higher osteogenic potential of Ti-Nano may be, at least in part, due to the integrin &alphaV, since its silencing reduced the osteoblast differentiation induced by nanotopography. We also demonstrated that the signaling pathway triggered by integrin β3 plays a key role in the osteogenic potential of Ti-Nano, but not of Ti-Micro. The silencing of integrin β3 reduced the osteoblast differentiation concomitantly with the negative regulation of the gene expression of several Wnt and BMP signaling components only in cells grown on Ti-Nano. Taken together, our results uncover a novel mechanism to explain the higher osteoblast differentiation induced by Ti-Nano that involves a complex regulatory network triggered by integrins αV and β3 upregulation, with the integrin β3 activating the Wnt and BMP signal transductions

O objetivo desse estudo foi investigar a participação de integrina &alpha;1&beta;1 e microRNAs (miRs) no potencial osteogênico de superfícies de titânio (Ti) com nanotopografia. Discos de Ti previamente polidos foram tratados quimicamente com H2SO4/H2O2 para obtenção de nanotopografia, que foi observada por microscopia eletrônica de varredura. Para o estudo da participação da integrina &alpha;1&beta;1, células-tronco mesenquimais (CTMs) de ratos foram cultivadas em condições osteogênicas e não osteogênicas sobre superfícies de Ti com nanotopografia e sem tratamento químico (controle). O resultados mostraram que a nanotopografia de Ti aumentou a proliferação celular, a atividade de fosfatase alcalina (Alp) e regulou positivamente a expressão gênica de marcadores da diferenciação osteoblástica em CTMs cultivadas tanto em condições osteogênicas quanto em condições não osteogênicas. Além disso, uma maior expressão gênica para as integrinas &alpha;1 e &beta;1 foi observada em culturas crescidas sobre nanotopografia em condições não osteogênicas em relação ao Ti controle. O uso de obtustatina, um inibidor de integrina &alpha;1&beta;1, reduziu os efeitos da nanotopografia sobre os marcadores osteoblásticos, indicando a participação da via de sinalização dessa integrina nos efeitos da nanotopografia sobre CTMs. Para investigar a participação de miRs no efeito osseoindutor da nanotopografia de Ti, foram utilizadas CTMs humanas e células préosteoblásticas de camundongos da linhagem MC3T3-E1. A análise em larga escala da expressão de miRs revelou que 60 miRs foram regulados positivamente (no mínimo, 2x maior), enquanto 58 miRs foram regulados negativamente (no mínimo, 2x menor) em CTMs crescidas sobre a nanotopografia. Três desses miRs, miR-4448, -4708 e -4773, cuja expressão foi significativamente reduzida pela nanotopografia de Ti (no mínimo, 5x menor), afetaram a diferenciação osteoblástica de CTMs. Esses miRs atuam diretamente sobre SMAD1 e SMAD4, proteínas transdutoras da sinalização da proteína óssea morfogenética 2 (Bmp-2), conhecida por sua capacidade osseoindutora. Além disso, verificou-se que a sobreexpressão de miR-4448, -4708 e -4773 em células pré-osteoblásticas MC3T3-E1 inibiu a expressão gênica e proteica de SMAD1 e SMAD4 e, consequentemente, a expressão gênica de marcadores ósseos. Esses dados sugerem a influência do circuito miR-SMAD-Bmp-2 sobre o efeito osseoindutor da nanotopografia. Conjuntamente, os achados do presente estudo mostraram que o efeito da nanotopografia de Ti sobre a diferenciação osteoblástica resulta de um mecanismo regulatório complexo, do qual fazem parte as vias de sinalização da integrina &alpha;1&beta;1 e da Bmp-2, com a participação de miRs. Esses resultados podem representar um avanço para o desenvolvimento de novas modificações de superfície, com o objetivo de acelerar e/ou melhorar o processo de osseointegração. / The aim of this study was to investigate the role of the &alpha;1&beta;1 integrin and microRNAs (miRs) on the osteogenic potential of titanium (Ti) with nanotopography. Polished Ti discs were chemically treated with H2SO4/H2O2 to generate nanotopography, which was observed under scanning electron microscopy. For the study related to the &alpha;1&beta;1 integrin, rat mesenchymal stem cells (MSCs) were cultured under osteogenic and non-osteogenic conditions on Ti with nanotopography and non-treated Ti discs (control). Nanotopography increased cell proliferation and alkaline phosphatase (Alp) activity and upregulated the gene expression of bone markers in cells cultured under osteogenic and non-osteogenic conditions. Furthermore, the gene expression of &alpha;1 and &beta;1 integrins was higher in cells cultured on nanotopography under non-osteogenic conditions compared with control. Obtustatin, an inhibitor of &alpha;1&beta;1 integrin, reduced the higher gene expression of the bone markers induced by nanotopography. These results indicate that &alpha;1&beta;1 integrin signaling pathway determines the osteoinductive effect of nanotopography on MSCs. The role of miRs in the osteogenic potential of Ti with nanotopography was evaluated using human MSCs and MC3T3-E1 mouse pre-osteoblastic cells. The miR sequencing analysis revealed that 60 miRs were upregulated (> 2 fold), while 58 miRs were downregulated (< 2 fold) in MSCs grown on nanotopography. Three miRs, miR-4448, -4708 and -4773, which were significantly downregulated (< 5 fold) by nanotopography, affected the osteoblast differentiation of MSCs. These miRs directly target SMAD1 and SMAD4, both key transducers of the bone morphogenetic protein 2 (Bmp-2) osteogenic signal, which were upregulated by nanotopography. Overexpression of miR-4448 - 4708 and 4773 in MC3T3-E1 cells noticeably inhibited gene and protein expression of SMAD1 and SMAD4 and by targeting them, these miRs repressed gene expression of key bone markers. These results suggest that a miR-SMAD-Bmp-2 circuit acts in the Ti nanotopography-mediated osteoblast differentiation. Taken together, our data showed that the osteoblast differentiation induced by Ti with nanotopography is governed by a complex regulatory network involving a crosstalk between &alpha;1&beta;1 integrin and Bmp-2 signaling pathways with participation of miRs.

A osseointegração de implantes de titânio (Ti) é dependente da interação entre a superfície de Ti e células, a qual é modulada por diversas vias de sinalização intracelular. Sabe-se que as quinases reguladas por sinais extracelulares (ERKs), membros da família das proteínas quinases ativadas por mitógenos (MAPKs), atuam tanto na osteogênese, quanto na adipogênese e, portanto, podem estar envolvidas no processo de osseointegração de Ti. Nesse contexto, o objetivo do presente estudo foi avaliar se a interação entre células-tronco mesenquimais (CTMs) e superfícies de Ti usinada e com nanotopografia é modulada, ao menos em parte, por ERK1/2 e o consequente efeito da inibição dessas ERKs na diferenciação osteoblástica e adipocítica. Para isso, CTMs derivadas de medula óssea de ratos foram cultivadas sobre discos de Ti usinados e com nanotopografia em condições osteogênicas e adipogênicas, na presença ou não do inibidor de ERK1/2, PD98059, em concentração previamente determinada (25 &mu;M) e foram avaliados parâmetros relacionados à diferenciação osteoblástica e adipocítica. Os resultados mostraram que a expressão gênica dos marcadores osteoblásticos RUNX2, osterix (OSX), fosfatase alcalina (ALP) e osteocalcina (OC) foi aumentada pela inibição da via de sinalização de ERK1/2 nas células crescidas sobre Ti usinado e apenas ALP e OC, naquelas crescidas sobre Ti com nanotopografia. A expressão proteica de RUNX2 foi discretamente maior nas células crescidas sobre Ti usinado, mas não sobre Ti com nanotopografia, quando ERK1/2 foram inibidas e essa inibição não afetou a formação de matriz extracelular mineralizada, independentemente da superfície de Ti avaliada. Com relação à diferenciação adipocítica, a inibição da via de sinalização de ERK1/2 aumentou a expressão gênica dos marcadores adipocíticos PPAR&gamma;, adiponectina (ADIPOQ) e proteína ligadora de ácido graxo do adipócito ( AP2) nas células crescidas sobre ambas as superfícies de Ti, com efeito mais acentuado na superfície usinada, sem afetar a formação de acúmulo lípidico. Em conclusão, os resultados mostraram que a inibição de ERK1/2 favoreceu a diferenciação osteoblástica de CTMs crescidas sobre a superfície de Ti usinada, mas não sobre Ti com nanotopografia. Além disso, a inibição de ERK1/2 favoreceu a diferenciação adipocítica de CTMs crescidas sobre as superfícies de Ti com nanotopografia e usinada, sendo o efeito mais acentuado na usinada. Considerando aplicações terapêuticas, esses resultados são relevantes para direcionar o desenvolvimento de superfícies de biomateriais que atuem em vias de sinalização que sabidamente modulam o processo de osteogênese. / Osseointegration of titanium (Ti) implants depends on interaction between Ti surface and cells, which is modulated by several intracellular signaling pathways. Extracellular signal-regulated kinases (ERKs) are members of mitogen-activated protein kinases (MAPKs) family and act on both osteogenesis and adipogenesis and, therefore, may be involved in the process of Ti osseointegration. In this context, the aim of this study was to evaluate if the interaction between mesenchymal stem cells (MSCs) and Ti surfaces, either machined or with nanotopography, is modulated, at least in part, by ERK1/2 and the effect of ERK1/2 inhibition on osteoblast and adipocyte differentiation. Rat bone marrow MSCs were cultured on Ti discs either machined or with nanotopography under osteogenic and adipogenic conditions, in presence or not of the ERK1/2 inhibitor, PD98059, at a concentration previously determined (25 &mu;M) and it was evaluated parameters related to osteoblast and adipocyte differentiation. The results showed that gene expression of the bone markers RUNX2, osterix (OSX), alkaline phosphatase (ALP) and osteocalcin (OC) was increased by ERK1/2 signaling inhibition in cells grown on machined Ti and only ALP and OC in cells grown on Ti with nanotopography. RUNX2 protein expression was slightly higher in cells grown on machined Ti, but not on Ti with nanotopography, when ERK1/2 signaling was inhibited and such inhibition did not affect extracellular matrix mineralization, irrespective of the evaluated Ti surface. Regarding adipocyte differentiation, ERK1/2 signaling inhibition increased gene expression of the adipose tissue markers PPAR&gamma;, adiponectin (ADIPOQ) and adipocyte fatty acid-binding protein (AP2) in cells grown on both Ti surfaces, with more prominet effect on machined one, without affecting lipid accumulation. In conclusion, our results showed that ERK1/2 signaling inhibition favored osteoblast differentiation of MSCs grown on machined Ti, but not on Ti with nanotopography. In addition, ERK1/2 signaling inhibition favored adipocyte differentiation of MSCs grown on both Ti surfaces, being more noticeable on machined one. Considering therapeutical applications, these results are relevant to drive the development of biomaterial surfaces to act on signaling pathways that regulate the process of osteogenesis.

Modificações bioquímicas de topografias complexas de Ti permitem o desenvolvimento de novas superfícies de implantes funcionalizadas com moléculas bioativas, visando a promover a osteogênese de contato e a osseointegração. O objetivo do presente estudo foi avaliar o desenvolvimento do fenótipo osteogênico in vitro sobre diferentes nanotopografias de titânio (Ti) funcionalizadas com o fator de crescimento GDF-5. Células osteogênicas derivadas de calvária de ratos recém-nascidos foram plaqueadas e cultivadas por até 14 dias sobre superfícies de discos de Ti: 1) Controle (usinada e polida); 2) 30&prime; (com nanotopografia de nanoporos menores, obtida por condicionamento em solução de H2SO4/H2O2 por 30 min); 3) 30&prime;+GDF-5 (nanotopografia de 30&prime;, pré-adsorvida com GDF-5 a 200 ng/mL); 4) 4h (com nanotopografia de nanoporos maiores, obtida por condicionamento em H2SO4/H2O2 por 4 h); 5) 4h+GDF-5 (nanotopografia de 4h, pré-adsorvida com GDF-5 a 200 ng/mL). A adsorção de GDF-5 foi realizada a 4 ºC por 12 h no dia anterior ao plaqueamento das células. Os resultados mostraram que não houve diferenças estatisticamente significantes entre os grupos para a viabilidade celular em 1, 3 e 7 dias. Em 3 dias, as células estavam aderidas e espraiadas sobre todas as superfícies e acúmulos extracelulares extensos de OPN foram encontrados apenas sobre superfícies com nanotopografia de 4h e de 30&prime;+GDF-5. A expressão de RNAm para RUNX2 e ALP foi maior em 7 dias se comparada a 10 dias, sendo os menores valores encontrados para o grupo 4h+GDF-5. A expressão de OPN aumentou de 7 para 10 dias, exceto para 30&prime;+GDF-5, que se manteve inalterada. Enquanto que os níveis de RNAm para BSP aumentaram de 7 para 10 dias no Controle, redução significativa foi observada para os demais grupos, exceto para 30&prime;, em que se manteve constante. Culturas crescidas sobre nanotopografias funcionalizadas com GDF-5 exibiram os maiores valores de atividade de ALP em 10 dias e de áreas de matriz mineralizada/acúmulos de cálcio em 14 dias. Em conclusão, a funcionalização de nanotopografias de Ti com GDF-5 pode acelerar e/ou aumentar a expressão do fenótipo osteogênico in vitro. / Surface functionalization of metallic surfaces with bioactive molecules has been developed aiming to promote specific cellular responses at the biomaterial-tissue interface. The present study evaluated the development of the osteogenic phenotype in vitro on titanium (Ti) surface nanotopographies functionalized with growth and differentiation factor-5 (GDF-5). Osteogenic cells were obtained by enzymatic digestion of newborn rat calvarial bone and grown for periods of up to 14 days on the following Ti disc surfaces: 1) Machined; 2) 30&prime; Nanotopography created by a mixture of H2SO4/H2O2 for 30 min; 3) 30&prime;+GDF-5 Nanotopography created by a mixture of H2SO4/H2O2 for 30 min and then adsorbed with 200 ng/mL GDF-5 (overnight at 4 °C); 4) 4h Nanotopography created by a mixture of H2SO4/H2O2 for 4 h; 5) 4h+GDF-5 Nanotopography created by a mixture of H2SO4/H2O2 for 4 h and then adsorbed with 200 ng/mL GDF-5 (overnight at 4 °C). At 4 h, nanotopographies adsorbed with GDF-5 exhibited a significantly lower proportion of spread cells. At days 1, 3 and 7 no major differences in terms of cell viability were detected among groups. At day 3, epifluorescence revealed large extracellular OPN accumulation only for 30&prime;+GDF-5, 4h and 4h+GDF-5. Real time PCR analysis showed for GDF-5 groups: i) lower mRNA levels for RUNX2, ALP e BSP at day 10; ii) higher RUNX2 and ALP expression at day 7 compared with day 10, with the lowest levels for 4h+GDF-5; iii) increased OPN levels from day 7 to day 10, except for 30&prime;+GDF-5, which remained unaltered. Cultures grown on nanotopographies adsorbed with GDF-5 exhibited significantly higher values for ALP activity at 10 days and enhanced mineralized matrix formation at day 14. In conclusion, surface functionalization of Ti nanotopographies with GDF-5 can accelerate and/or increase the expression of the osteogenic phenotype in vitro.

Estudo anterior de nosso grupo demonstrou que superfície de titânio (Ti) com nanotopografia obtida por condicionamento com H2SO4/H2O2 e funcionalizada com GDF-5 por simples adsorção promove o aumento da mineralização de culturas primárias de células osteogênicas. O presente estudo teve como objetivos avaliar: 1) os efeitos da pós-adsorção de proteínas principais do plasma- albumina, fibrinogênio e fibronectina, em superfícies de Ti controle e com nanotopografia, funcionalizadas com GDF-5 a 200 ng/mL por simples adsorção, sobre a formação de matriz mineralizada in vitro; 2) parâmetros moleculares e fenotípicos característicos da aquisição do fenótipo osteogênico in vitro sobre superfícies de Ti funcionalizadas com GDF-5 por simples adsorção ou por filmes LbL; 3) parâmetros de formação óssea adjacente a implantes de Ti com nanotopografia funcionalizada com GDF-5 pelos dois métodos, em modelo de tíbia de coelhos. Os resultados mostraram que a pós-adsorção de proteínas plasmáticas não afetou o potencial osteogênico in vitro, com exceção para o efeito inibidor da albumina, quando pós-adsorvida isoladamente. Tanto a superfície de Ti como o método de funcionalização de GDF-5 afetaram, quantitativamente, as formações de matriz mineralizada, com a maior diferenciação osteogênica para Ti com nanotopografia funcionalizada com GDF-5 por simples adsorção e a menor, para os filmes LbL, independentemente das superfícies sobre as quais eles eram montados. A atividade de ALP foi maior em culturas sobre nanotopografia de Ti, incluindo aquelas funcionalizadas com GDF-5, cujos valores, no entanto, não corresponderam, necessariamente, à maior atividade osteogênica. Apesar disso, todos os grupos exibiram expressão de marcadores de diferenciação osteoblástica, com sobre-expressão de osteopontina e osteocalcina para culturas sobre LbL. As análises microtomográfica, histológica e histomorfométrica não revelaram diferenças qualitativas e quantitativas in vivo entre nanotopografias de Ti funcionalizadas ou não com GDF-5, ainda que uma tendência à maior formação óssea tenha sido observada para as superfícies funcionalizadas e, entre essas, para os filmes LbL. Considerados conjuntamente, os resultados do presente estudo contribuem para o melhor entendimento das respostas de osteoblastos e do tecido ósseo quando se propõe a estratégia de funcionalização de superfícies de Ti com GDF-5 visando à otimização da osseointegração. / It has been demonstrated that a nanostructured titanium (Ti) surface obtained by treatment with H2SO4/H2O2 and functionalized with GDF-5 by simple adsorption promotes the enhancement of mineralized matrix formation in osteogenic cell cultures. This study aimed to evaluate: 1) the effects of post-adsorption of major plasma proteins, i.e. albumin, fibrinogen and fibronectin, on control and nanostructured Ti surfaces, functionalized with 200 ng/mL GDF-5 by simple adsorption, on mineralized matrix formation by calvarial osteogenic cell cultures; 2) molecular and phenotypic parameters characteristics of the acquisition of the osteogenic phenotype in vitro on Ti surfaces functionalized with GDF-5 by either simple adsorption or layer by layer (LbL) films; 3) parameters of bone formation adjacent to Ti implants with a nanostructured surface functionalized with GDF-5 by the two methods described in item 2, in a rabbit tibia model. The results showed that the post-adsorption of plasma proteins did not affect the osteogenic potential of cultures, except for the inhibitory effect of albumin when post-adsorbed alone. Either the Ti surface topography or the method for GDF-5 functionalization quantitatively affected mineralized matrix formation, with the higher osteogenic differentiation for nanostructured Ti functionalized with GDF-5 by simple adsorption and the lower one for LbL films, irrespective of the Ti surface topography on which they were mounted. ALP activity was higher for cultures grown on nanostructured Ti, including those functionalized with GDF-5, whose values, however, did not necessarily correspond to the higher osteogenic activity. Despite that, all groups expressed osteoblast differentiation markers, with a remarkable increase in osteopontin and osteocalcin mRNA levels for cultures grown on LbL films. The microtomographic, histologic and histomorphometric analyses revealed no qualitative or quantitative differences in vivo among the nanostructured Ti implants, yet a tendency for enhanced bone formation was observed for the functionalized surfaces and, between them, for the LbL films. Taken together, the results of the present in vitro and in vivo studies contribute to a better understanding of osteoblast and bone tissue responses to the functionalization of Ti surfaces with GDF-5 aiming to optimize osseointegration.

Estudo anterior de nosso grupo demonstrou que superfície de titânio (Ti) com nanotopografia obtida por condicionamento com H2SO4/H2O2 e funcionalizada com GDF-5 por simples adsorção promove o aumento da mineralização de culturas primárias de células osteogênicas. O presente estudo teve como objetivos avaliar: 1) os efeitos da pós-adsorção de proteínas principais do plasma- albumina, fibrinogênio e fibronectina, em superfícies de Ti controle e com nanotopografia, funcionalizadas com GDF-5 a 200 ng/mL por simples adsorção, sobre a formação de matriz mineralizada in vitro; 2) parâmetros moleculares e fenotípicos característicos da aquisição do fenótipo osteogênico in vitro sobre superfícies de Ti funcionalizadas com GDF-5 por simples adsorção ou por filmes LbL; 3) parâmetros de formação óssea adjacente a implantes de Ti com nanotopografia funcionalizada com GDF-5 pelos dois métodos, em modelo de tíbia de coelhos. Os resultados mostraram que a pós-adsorção de proteínas plasmáticas não afetou o potencial osteogênico in vitro, com exceção para o efeito inibidor da albumina, quando pós-adsorvida isoladamente. Tanto a superfície de Ti como o método de funcionalização de GDF-5 afetaram, quantitativamente, as formações de matriz mineralizada, com a maior diferenciação osteogênica para Ti com nanotopografia funcionalizada com GDF-5 por simples adsorção e a menor, para os filmes LbL, independentemente das superfícies sobre as quais eles eram montados. A atividade de ALP foi maior em culturas sobre nanotopografia de Ti, incluindo aquelas funcionalizadas com GDF-5, cujos valores, no entanto, não corresponderam, necessariamente, à maior atividade osteogênica. Apesar disso, todos os grupos exibiram expressão de marcadores de diferenciação osteoblástica, com sobre-expressão de osteopontina e osteocalcina para culturas sobre LbL. As análises microtomográfica, histológica e histomorfométrica não revelaram diferenças qualitativas e quantitativas in vivo entre nanotopografias de Ti funcionalizadas ou não com GDF-5, ainda que uma tendência à maior formação óssea tenha sido observada para as superfícies funcionalizadas e, entre essas, para os filmes LbL. Considerados conjuntamente, os resultados do presente estudo contribuem para o melhor entendimento das respostas de osteoblastos e do tecido ósseo quando se propõe a estratégia de funcionalização de superfícies de Ti com GDF-5 visando à otimização da osseointegração. / It has been demonstrated that a nanostructured titanium (Ti) surface obtained by treatment with H2SO4/H2O2 and functionalized with GDF-5 by simple adsorption promotes the enhancement of mineralized matrix formation in osteogenic cell cultures. This study aimed to evaluate: 1) the effects of post-adsorption of major plasma proteins, i.e. albumin, fibrinogen and fibronectin, on control and nanostructured Ti surfaces, functionalized with 200 ng/mL GDF-5 by simple adsorption, on mineralized matrix formation by calvarial osteogenic cell cultures; 2) molecular and phenotypic parameters characteristics of the acquisition of the osteogenic phenotype in vitro on Ti surfaces functionalized with GDF-5 by either simple adsorption or layer by layer (LbL) films; 3) parameters of bone formation adjacent to Ti implants with a nanostructured surface functionalized with GDF-5 by the two methods described in item 2, in a rabbit tibia model. The results showed that the post-adsorption of plasma proteins did not affect the osteogenic potential of cultures, except for the inhibitory effect of albumin when post-adsorbed alone. Either the Ti surface topography or the method for GDF-5 functionalization quantitatively affected mineralized matrix formation, with the higher osteogenic differentiation for nanostructured Ti functionalized with GDF-5 by simple adsorption and the lower one for LbL films, irrespective of the Ti surface topography on which they were mounted. ALP activity was higher for cultures grown on nanostructured Ti, including those functionalized with GDF-5, whose values, however, did not necessarily correspond to the higher osteogenic activity. Despite that, all groups expressed osteoblast differentiation markers, with a remarkable increase in osteopontin and osteocalcin mRNA levels for cultures grown on LbL films. The microtomographic, histologic and histomorphometric analyses revealed no qualitative or quantitative differences in vivo among the nanostructured Ti implants, yet a tendency for enhanced bone formation was observed for the functionalized surfaces and, between them, for the LbL films. Taken together, the results of the present in vitro and in vivo studies contribute to a better understanding of osteoblast and bone tissue responses to the functionalization of Ti surfaces with GDF-5 aiming to optimize osseointegration.

Modificações bioquímicas de topografias complexas de Ti permitem o desenvolvimento de novas superfícies de implantes funcionalizadas com moléculas bioativas, visando a promover a osteogênese de contato e a osseointegração. O objetivo do presente estudo foi avaliar o desenvolvimento do fenótipo osteogênico in vitro sobre diferentes nanotopografias de titânio (Ti) funcionalizadas com o fator de crescimento GDF-5. Células osteogênicas derivadas de calvária de ratos recém-nascidos foram plaqueadas e cultivadas por até 14 dias sobre superfícies de discos de Ti: 1) Controle (usinada e polida); 2) 30&prime; (com nanotopografia de nanoporos menores, obtida por condicionamento em solução de H2SO4/H2O2 por 30 min); 3) 30&prime;+GDF-5 (nanotopografia de 30&prime;, pré-adsorvida com GDF-5 a 200 ng/mL); 4) 4h (com nanotopografia de nanoporos maiores, obtida por condicionamento em H2SO4/H2O2 por 4 h); 5) 4h+GDF-5 (nanotopografia de 4h, pré-adsorvida com GDF-5 a 200 ng/mL). A adsorção de GDF-5 foi realizada a 4 ºC por 12 h no dia anterior ao plaqueamento das células. Os resultados mostraram que não houve diferenças estatisticamente significantes entre os grupos para a viabilidade celular em 1, 3 e 7 dias. Em 3 dias, as células estavam aderidas e espraiadas sobre todas as superfícies e acúmulos extracelulares extensos de OPN foram encontrados apenas sobre superfícies com nanotopografia de 4h e de 30&prime;+GDF-5. A expressão de RNAm para RUNX2 e ALP foi maior em 7 dias se comparada a 10 dias, sendo os menores valores encontrados para o grupo 4h+GDF-5. A expressão de OPN aumentou de 7 para 10 dias, exceto para 30&prime;+GDF-5, que se manteve inalterada. Enquanto que os níveis de RNAm para BSP aumentaram de 7 para 10 dias no Controle, redução significativa foi observada para os demais grupos, exceto para 30&prime;, em que se manteve constante. Culturas crescidas sobre nanotopografias funcionalizadas com GDF-5 exibiram os maiores valores de atividade de ALP em 10 dias e de áreas de matriz mineralizada/acúmulos de cálcio em 14 dias. Em conclusão, a funcionalização de nanotopografias de Ti com GDF-5 pode acelerar e/ou aumentar a expressão do fenótipo osteogênico in vitro. / Surface functionalization of metallic surfaces with bioactive molecules has been developed aiming to promote specific cellular responses at the biomaterial-tissue interface. The present study evaluated the development of the osteogenic phenotype in vitro on titanium (Ti) surface nanotopographies functionalized with growth and differentiation factor-5 (GDF-5). Osteogenic cells were obtained by enzymatic digestion of newborn rat calvarial bone and grown for periods of up to 14 days on the following Ti disc surfaces: 1) Machined; 2) 30&prime; Nanotopography created by a mixture of H2SO4/H2O2 for 30 min; 3) 30&prime;+GDF-5 Nanotopography created by a mixture of H2SO4/H2O2 for 30 min and then adsorbed with 200 ng/mL GDF-5 (overnight at 4 °C); 4) 4h Nanotopography created by a mixture of H2SO4/H2O2 for 4 h; 5) 4h+GDF-5 Nanotopography created by a mixture of H2SO4/H2O2 for 4 h and then adsorbed with 200 ng/mL GDF-5 (overnight at 4 °C). At 4 h, nanotopographies adsorbed with GDF-5 exhibited a significantly lower proportion of spread cells. At days 1, 3 and 7 no major differences in terms of cell viability were detected among groups. At day 3, epifluorescence revealed large extracellular OPN accumulation only for 30&prime;+GDF-5, 4h and 4h+GDF-5. Real time PCR analysis showed for GDF-5 groups: i) lower mRNA levels for RUNX2, ALP e BSP at day 10; ii) higher RUNX2 and ALP expression at day 7 compared with day 10, with the lowest levels for 4h+GDF-5; iii) increased OPN levels from day 7 to day 10, except for 30&prime;+GDF-5, which remained unaltered. Cultures grown on nanotopographies adsorbed with GDF-5 exhibited significantly higher values for ALP activity at 10 days and enhanced mineralized matrix formation at day 14. In conclusion, surface functionalization of Ti nanotopographies with GDF-5 can accelerate and/or increase the expression of the osteogenic phenotype in vitro.

O objetivo desse estudo foi investigar a participação de integrina &alpha;1&beta;1 e microRNAs (miRs) no potencial osteogênico de superfícies de titânio (Ti) com nanotopografia. Discos de Ti previamente polidos foram tratados quimicamente com H2SO4/H2O2 para obtenção de nanotopografia, que foi observada por microscopia eletrônica de varredura. Para o estudo da participação da integrina &alpha;1&beta;1, células-tronco mesenquimais (CTMs) de ratos foram cultivadas em condições osteogênicas e não osteogênicas sobre superfícies de Ti com nanotopografia e sem tratamento químico (controle). O resultados mostraram que a nanotopografia de Ti aumentou a proliferação celular, a atividade de fosfatase alcalina (Alp) e regulou positivamente a expressão gênica de marcadores da diferenciação osteoblástica em CTMs cultivadas tanto em condições osteogênicas quanto em condições não osteogênicas. Além disso, uma maior expressão gênica para as integrinas &alpha;1 e &beta;1 foi observada em culturas crescidas sobre nanotopografia em condições não osteogênicas em relação ao Ti controle. O uso de obtustatina, um inibidor de integrina &alpha;1&beta;1, reduziu os efeitos da nanotopografia sobre os marcadores osteoblásticos, indicando a participação da via de sinalização dessa integrina nos efeitos da nanotopografia sobre CTMs. Para investigar a participação de miRs no efeito osseoindutor da nanotopografia de Ti, foram utilizadas CTMs humanas e células préosteoblásticas de camundongos da linhagem MC3T3-E1. A análise em larga escala da expressão de miRs revelou que 60 miRs foram regulados positivamente (no mínimo, 2x maior), enquanto 58 miRs foram regulados negativamente (no mínimo, 2x menor) em CTMs crescidas sobre a nanotopografia. Três desses miRs, miR-4448, -4708 e -4773, cuja expressão foi significativamente reduzida pela nanotopografia de Ti (no mínimo, 5x menor), afetaram a diferenciação osteoblástica de CTMs. Esses miRs atuam diretamente sobre SMAD1 e SMAD4, proteínas transdutoras da sinalização da proteína óssea morfogenética 2 (Bmp-2), conhecida por sua capacidade osseoindutora. Além disso, verificou-se que a sobreexpressão de miR-4448, -4708 e -4773 em células pré-osteoblásticas MC3T3-E1 inibiu a expressão gênica e proteica de SMAD1 e SMAD4 e, consequentemente, a expressão gênica de marcadores ósseos. Esses dados sugerem a influência do circuito miR-SMAD-Bmp-2 sobre o efeito osseoindutor da nanotopografia. Conjuntamente, os achados do presente estudo mostraram que o efeito da nanotopografia de Ti sobre a diferenciação osteoblástica resulta de um mecanismo regulatório complexo, do qual fazem parte as vias de sinalização da integrina &alpha;1&beta;1 e da Bmp-2, com a participação de miRs. Esses resultados podem representar um avanço para o desenvolvimento de novas modificações de superfície, com o objetivo de acelerar e/ou melhorar o processo de osseointegração. / The aim of this study was to investigate the role of the &alpha;1&beta;1 integrin and microRNAs (miRs) on the osteogenic potential of titanium (Ti) with nanotopography. Polished Ti discs were chemically treated with H2SO4/H2O2 to generate nanotopography, which was observed under scanning electron microscopy. For the study related to the &alpha;1&beta;1 integrin, rat mesenchymal stem cells (MSCs) were cultured under osteogenic and non-osteogenic conditions on Ti with nanotopography and non-treated Ti discs (control). Nanotopography increased cell proliferation and alkaline phosphatase (Alp) activity and upregulated the gene expression of bone markers in cells cultured under osteogenic and non-osteogenic conditions. Furthermore, the gene expression of &alpha;1 and &beta;1 integrins was higher in cells cultured on nanotopography under non-osteogenic conditions compared with control. Obtustatin, an inhibitor of &alpha;1&beta;1 integrin, reduced the higher gene expression of the bone markers induced by nanotopography. These results indicate that &alpha;1&beta;1 integrin signaling pathway determines the osteoinductive effect of nanotopography on MSCs. The role of miRs in the osteogenic potential of Ti with nanotopography was evaluated using human MSCs and MC3T3-E1 mouse pre-osteoblastic cells. The miR sequencing analysis revealed that 60 miRs were upregulated (> 2 fold), while 58 miRs were downregulated (< 2 fold) in MSCs grown on nanotopography. Three miRs, miR-4448, -4708 and -4773, which were significantly downregulated (< 5 fold) by nanotopography, affected the osteoblast differentiation of MSCs. These miRs directly target SMAD1 and SMAD4, both key transducers of the bone morphogenetic protein 2 (Bmp-2) osteogenic signal, which were upregulated by nanotopography. Overexpression of miR-4448 - 4708 and 4773 in MC3T3-E1 cells noticeably inhibited gene and protein expression of SMAD1 and SMAD4 and by targeting them, these miRs repressed gene expression of key bone markers. These results suggest that a miR-SMAD-Bmp-2 circuit acts in the Ti nanotopography-mediated osteoblast differentiation. Taken together, our data showed that the osteoblast differentiation induced by Ti with nanotopography is governed by a complex regulatory network involving a crosstalk between &alpha;1&beta;1 integrin and Bmp-2 signaling pathways with participation of miRs.