Revascularização é uma técnica utilizada em dentes jovens, que apresentem rizogênese incompleta e danos irreversíveis ao tecido pulpar, necessitando de tratamento endodôntico, para formar novo tecido em lugar da polpa perdida. Clinicamente os resultados mostram a continuidade da rizogênese e a devolução da vitalidade dental. Porém, pouco se sabe sobre o novo tecido formado e não está estabelecido se este é capaz de desempenhar todas as funções da polpa dentária. Para melhorar as características do tecido formado pela técnica da revascularização, podemos utilizar ferramentas de engenharia tecidual, como célulastronco, fatores de crescimento e arcabouços de sustentação celular (scaffolds). As célulastronco (CTs) já estão presentes quando o sangue invade o canal radicular, e utilizar essa reserva de CTs que o hospedeiro possui, procedimento conhecido como homing, é uma vantagem em comparação com outras técnicas que injetam CTs obtidas por cultivo em laboratório. Entretanto os aspectos físicos do coágulo sanguíneo formado no interior do canal radicular podem ser melhorados com a adição de hidrogel de quitosana, que interage quimicamente com o sangue e forma um scaffold híbrido mais estável. Então, o objetivo deste estudo foi testar a hipótese de que o scaffold híbrido, composto por hidrogel de quitosana e sangue, ofereceria maior estabilidade física estrutural, bem como condições favoráveis à adesão e proliferação de células-tronco da papila apical humana (SCAPs; do inglês, Stem Cell from Apical Papila). Para isso, investigamos in vitro se a incorporação do sangue ao hidrogel de quitosana gera um scaffold mais estável, se este é favorável à adesão e proliferação de células-tronco da papila apical e se a fotobiomodulação potencializa essas características celulares. Para isso, SCAPs foram isoladas e caracterizadas por citometria de fluxo, tempo de dobra populacional, e contagem de unidades formadoras de colônias fibroblásticas (CFU-F; do inglês, Colony Forming Units - Fibroblastic). Ensaios de incorporação sanguínea, dissolução e embebição foram realizados para determinar o comportamento dos scaffolds híbridos. A adesão celular foi observada pela coloração PHK26® (do inglês, Red Fluorescent Cell Linker) e por microscopias eletrônicas de varredura (MEV); e a proliferação foi investigada pelo ensaio de alamarBlue®. Adicionalmente, a sobrevivência das SCAPs após a degradação do scaffold híbrido foi avaliada pela coloração Live/Dead®. A população celular estudada apresentou características de células tronco. O scaffold híbrido, constituído de densa rede alveolar com poros interconectados, embebeu e dissolveu rapidamente. De acordo com o PKH26® e alamarBlue® SCAPs aderiram e proliferaram no scaffold híbrido. SCAPs fotobiomoduladas exibiram maior taxa de proliferação e o ensaio Live/Dead® mostrou células vivas após 12 dias de cultivo. Concluiu-se que o scaffold híbrido apresenta biocompatibilidade e condições favoráveis de sobrevivência para SCAPs, que são potencializadas pela fotobiomodulação. / Revascularization is a technique used to form a new tissue, replacing the lost pulp, in young permanent teeth presenting incomplete rhizogenesis and irreversible damage, where endodontic treatment is needed. Clinically, the results show the continuity of the root formation and the return of dental vitality. However, little is known about the newly formed tissue and it has not been established if it is able to perform all functions of the dental pulp. To improve the characteristics of the newly formed tissue by the technique of revascularization, tissue engineering tools can be used, represented by stem cells, growth factors and scaffolds for cell supportting. Stem cells (SCs) are already present when the blood invades the root canal, and to use this SCs reserve that the host possesses, procedure known as homing, is an advantage compared with other techniques that inject SCs obtained by cultivation in the laboratory. However the physical aspects of blood clot in the root canal can be improved with the addition of chitosan hydrogel that chemically interacts with the blood and forms a more stable hybrid scaffold. So the aim of this study was to test the hypothesis that the hybrid scaffold, composed of hydrogel chitosan and blood clot, provides greater structural physical stability as well as favorable conditions for adhesion and proliferation of Stem Cells from Apical Papilla (SCAPs). For this, we investigated in vitro if the incorporation of blood to chitosan hydrogel, generates a more stable scaffold and if it supports the stem cell adhesion and proliferation, in addition, if photobiomodulation potentiates these cell characteristics. For this, SCAPs were isolated and characterized by flow cytometry, population doubling time, and counting colony forming units - fibroblastic (CFUF). Blood incorporation assays, dissolution and swelling were conducted to determine the behavior of hybrid scaffolds. Cell adhesion was observed by PHK26® (Red Fluorescent Cell Linker) and scanning electron microscopy (SEM); and proliferation was investigated by alamarBlue® assay. In addition, the survival of SCAPs after degradation of the scaffold was assessed by Live/Dead® staining. The cell population showed stem cell characteristics. The hybrid scaffold, constituted of dense cellular network with interconnected pores, soaked and dissolved quickly. According to PKH26® and alamarBlue® assays, the SCAPs adhered and proliferated in the hybrid scaffold. Photobiomodulation leads to SCAPs higher proliferation rate and the Live/Dead® test showed live cells after 12 days of cultivation. It was concluded that the hybrid scaffold is biocompatible and favors survival of SCAPs, which was enhanced by photobiomodulation.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-06032017-102455 |
| Date | 06 September 2016 |
| Creators | Abe, Gabriela Laranjeira |
| Contributors | Marques, Marcia Martins |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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