Fundação de Amparo a Pesquisa no Estado do Rio Grande do Sul / The oomycete Pythium insidiosum, classified in the kingdom Straminipila, is the agent of pythiosis, a chronic disease that can be hard to treat and life-threatening. The predisposing factors in mammals are unknown, but the iron overload is suspected to act directly or indirectly in the development of the infection. This aim of this study was: to evaluate the iron metabolism in rabbits with experimental pythiosis; to verify the antifungal activity and the mechanism of action in vitro of the iron chelator deferasirox against P. insidiosum isolates and to compared the treatment and the mechanism of action of the drug with immunotherapy in vivo; to verify the antifungal activity of micafungin, alone and in combination with deferasirox, in vitro and in vivo; to develop an experimental model of pythiosis using the fruit-fly Drosophila melanogaster with iron overload. The drug susceptibility tests included 17 P. insidiosum clinical isolates, and were performed according to the CLSI M38-A2 guidelines. The mechanism of action of deferasirox was evaluated by the XTT and DiBAC assays. For the in vivo tests, five P. insidiosum infected rabbits were included per group, as follows: infected treated with placebo, treated with immunotherapy, treated with deferasirox, treated with immunotherapy and deferasirox, treated with micafungin and treated with micafungin and deferasirox. Five uninfected rabbits were used as controls. Hematological and biochemical analyses were performed at days 0 25, 50 and 75 post-infection. The quantification of iron in the hepatocytes was performed after 50 days of treatment (day 75). The mechanism of action of deferasirox was evaluated by the quantification of the catabolic enzyme adenosine deaminase and by the histology of the subcutaneous lesions. The results show that P. insidiosum is poorly susceptible to deferasirox in vitro, with minimum inhibition concentrations (MICs) ranging from 12.5 to 50 μg/ml and minimum fungicidal
concentrations between 50 and 100 μg/ml. No activity against P. insidiosum was observed for micafungin in vitro (MICs > 128 μg/ml) and in rabbits with pythiosis. Notwithstanding, synergism was observed in 88% of the isolates when micafungin was combined with deferasirox, and the lesions were decreased in comparison to the other groups (P = 0.06). In general, the rabbits showed microcytic hypochromic anemia with depleted iron stores, which was less prominent in the groups treated with immunotherapy or deferasirox. Despite the iron chelator has failed to thwart the infection, deferasirox showed toxicity against P. insidiosum hyphae in vitro and an immunomodulatory action was observed in the lesions, in a similar pattern to that seen in immunotherapy-treated rabbits. However, the use of deferasirox favored the dissemination of the disease to the lung by unrevealed mechanisms. D. melanogaster flies were resistant to P. insidiosum infection, independently of the iron overload. Conversely, toll-deficient D. melanogaster flies were susceptible to the infection, highlighting the importance of these receptors in pythiosis. In conclusion, rabbits with pythiosis showed iron deficiency anemia and, despite the chelating effect of deferasirox, the administration of the drug should be evaluated with care because of the dissemination of the disease observed in some of the treated animals. / O oomiceto Pythium insidiosum, classificado no Reino Straminipila, é o agente etiológico da pitiose, uma doença crônica, de difícil tratamento e que pode levar à morte. Os fatores predisponentes da doença em mamíferos não são conhecidos, mas suspeita-se que a sobrecarga de ferro exerça um papel direto ou indireto no desenvolvimento da infecção. Este estudo teve por objetivos: avaliar o metabolismo do ferro em coelhos com pitiose experimental; verificar a atividade antifúngica e o mecanismo de ação in vitro do quelante de ferro deferasirox frente a isolados de P. insidiosum e comparar o tratamento e o mecanismo de ação do fármaco com a imunoterapia in vivo; verificar a atividade antifúngica da micafungina, sozinha e em combinação com deferasirox, in vitro e in vivo; desenvolver um modelo experimental de pitiose utilizando-se a mosca-das-frutas Drosophila melanogaster com sobrecarga de ferro. Os testes de susceptibilidade aos fármacos foram realizados com 17 isolados clínicos de P. insidiosum, utilizando-se o protocolo de microdiluição M38-A2 do CLSI. O mecanismo de ação in vitro do deferasirox foi avaliado através da técnica de XTT e DiBAC. Para os testes in vivo, foram utilizados cinco coelhos infectados por P. insdiosum por grupo, conforme o delineamento a seguir: infectados tratados com placebo, tratados com imunoterápico, tratados com deferasirox, tratados com imunoterápico e deferasirox, tratados com micafungina e tratados com micafungina e deferasirox. Cinco coelhos não infectados foram utilizados como controle negativo. Realizaram-se avaliações hematológicas e bioquímicas, incluindo os níveis séricos de ferro, transferrina e ferritina nos dias 0, 25, 50 e 75 pós-infecção. A quantificação do ferro depositado nos hepatócitos foi realizada após 50 dias de tratamento (dia 75). O mecanismo de ação do deferasirox in vivo foi avaliado
através da mensuração da atividade da enzima catabólica adenosina deaminase e da histologia das lesões subcutâneas. Os resultados mostram que P. insidiosum demonstrou ser pouco susceptível ao deferasirox in vitro, com concentrações inibitórias mínimas (CIMs) que variaram de 12,5 a 50 μg/ml e concentrações fungicidas mínimas entre 50 e 100 μg/ml. A micafungina não apresentou atividade antifúngica contra P. insidiosum in vitro (CIMs > 128 μg/ml) e nos coelhos com pitiose. Contudo, sinergismo foi observado em 88% dos isolados quando a micafungina foi associada ao deferasirox, e as lesões dos coelhos estavam diminuídas em relação aos demais grupos (P = 0,06). No geral, os coelhos infectados apresentaram anemia microcítica hipocrômica com depleção das reservas corporais de ferro, que foi menos acentuada nos grupos tratados com imunoterápico ou quelante de ferro. Apesar do deferasirox não ter sido capaz de conter a infecção, o mesmo teve ação tóxica sobre as hifas de P. insidiosum in vitro e teve ação imunomodulatória sobre as lesões, em um padrão similar ao observado nos coelhos tratados com imunoterapia. Contudo, o uso do deferasirox favoreceu a disseminação pulmonar da doença por mecanismos não compreendidos. Moscas D. melanogaster foram resistentes à infecção por P. insidiosum, independente da sobrecarga de ferro. Entretanto, D. melanogaster deficientes de receptores do tipo Toll foram susceptíveis à infecção, evidenciando a importância desses receptores na pitiose. Em conclusão, coelhos com pitiose apresentaram anemia por deficiência de ferro e, apesar do efeito quelante do deferasirox, a utilização do mesmo deve ser avaliada com cuidado devido à disseminação da doença em alguns animais.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufsm.br:1/3850 |
| Date | 30 January 2014 |
| Creators | Zanette, Régis Adriel |
| Contributors | Santurio, Janio Morais, Pereira, Daniela Isabel Brayer, Ferreiro, Laerte, Fighera, Rafael Almeida, Alves, Sydney Hartz |
| Publisher | Universidade Federal de Santa Maria, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, UFSM, BR, Farmacologia |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFSM, instname:Universidade Federal de Santa Maria, instacron:UFSM |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | 201000000000, 400, 300, 300, 500, 300, 300, 500, 06a1b29c-fde0-4a69-8097-2a9d6a9d9649, 2904913a-4762-4bd3-9081-626d6556de97, 8cf0f648-751e-463b-8607-0f38cce0874c, 454f3472-85a4-40cf-bd9c-da50e61ce233, a1a6ad54-9b6e-43c6-b8bd-6f4a6462eff8, 84b161a9-565b-45c2-9b62-dfd4be4b3f15 |
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