O etanol possui grande importância estratégica para o setor energético brasileiro devido a sua natureza renovável e grande capacidade de geração de emprego e renda. Atualmente um dos principais desafios enfrentados pelas indústrias brasileiras de produção de etanol é a presença de bactérias contaminando as fermentações. Essas atuam modificando o sistema, competindo por nutrientes essenciais, produzindo compostos tóxicos para a levedura e induzindo processos indesejáveis para a indústria como a floculação. Para equilibrar as populações e controlar os efeitos negativos é necessário uma melhor compreensão dos mecanismos genéticos e fisiológicos envolvidos nas interações de bactérias e leveduras em fermentações em fermentações etanólicas de primeira geração (1G). Neste sentido o presente trabalho realizou o sequenciamento, montagem e anotação completa dos genomas de três linhagens bacterianas isoladas diretamente de usinas brasileiras de produção de etanol: Lactobacillus sp. I-2, Lactobacillus sp. L-10 e Acetobacter sp. A-3. Além disso, foram feitas simulações da condição de co-existência entre bactérias lácticas e Acéticas com as leveduras de S. cerevisiae em fermentações semi-industriais em batelada alimentada (\"Melle-Boinot\") com tratamento ácido e reciclo de células. Três condições experimentais foram avaliadas: (i) fermentações contendo apenas leveduras de S. cerevisiae CAT-1, (ii) fermentações contendo leveduras de S. cerevisiae CAT-1 e bactérias de Lactobacillus sp. I-2, e (iii) fermentações contendo leveduras de S. cerevisiae CAT-1 e bactérias de Acetobacter sp. A-3. Por fim, os metabolomas das bactérias e leveduras da condição de coexistência nos ensaios fermentativos foram obtidos por metodologias de cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas (GC-MS). Foram identificados 3056, 2112 e 3557 genes nos genomas de Lactobacillus sp. L-10, Lactobacillus sp. I-2 e Acetobacter sp. A-3, respectivamente. As leveduras de S. cerevisiae, independente da condição experimental avaliada, consumiram totalmente os açúcares redutores totais (ART) presentes no melaço de cana-de-açúcar ao longo das fermentações em batelada alimentada. A glicina, aminoácido polar contendo apenas um hidrogênio na cadeia lateral, apresentou maior abundância durante as fermentações contaminadas com bactérias lácticas e acéticas em detrimento da condição controle sem contaminação bacteriana. Especula-se que o acúmulo intracelular deste aminoácido seja resultado do desvio de intermediários das vias Glicólise e Ciclo do Ácido Cítrico para a produção de compostos nitrogenados. Provavelmente, ambos os microrganismos, bactérias e leveduras, acumularam glicina no ambiente intracelular como alternativa a deficiência de nitrogênio no melaço de cana-de-açúcar. O sequenciamento dos genomas das bactérias e os ensaios fermentativos em biorreatores foram realizados no Laboratório Nacional de Biorrenováveis (LNBR) do Centro Nacional de Pesquisas em Energias e Materiais (CNPEM). As análises de metabolômica foram realizadas no Laboratório Max Feffer de Genética de Plantas da Escola Superior de Agricultura \"Luiz de Queiroz\" (ESALQ). Espera-se que os resultados apresentados neste trabalho agreguem mais informações a cerca das interações entre bactérias e leveduras e contribua, num futuro próximo, no apontamento de novas estratégias de controle bacteriano que sejam mais eficientes e sustentáveis que as usadas atualmente em fermentações industriais brasileiras. / Ethanol has great strategic importance for the Brazilian energy sector due to its renewable nature and great capacity to generate jobs and income. Currently, one of the main challenges faced by the Brazilian ethanol industry is the presence of contaminating bacteria in the fermentation tanks. They act by modifying the system, competing for essential nutrients, producing toxic compounds to the yeast and inducing undesirable processes for the industry like flocculation. To better balance populations and to control the negative effects, it is necessary a better understanding of the genetic and physiological mechanisms involved in the interactions among bacteria and yeasts from Saccharomyces cerevisiae. In this sense, the present work carried out the sequencing, assembly and complete genome annotation of three bacterial strains isolated directly from Brazilian ethanol production plants: Lactobacillus sp. I-2, Lactobacillus sp. L-10 and Acetobacter sp. A-3. In addition, simulations of the co-existence condition between lactic and acetic bacteria with yeasts from S. cerevisiae were carried out in semi-industrial fed-batch (Melle-Boinot) fermentations with acid treatment and cell recycling. Three experimental conditions were evaluated: (i) fermentations containing only yeasts from S. cerevisiae CAT-1, (ii) fermentations containing yeasts of S. cerevisiae CAT-1 and bacteria from Lactobacillus sp. I-2, and (iii) fermentations containing yeasts from S. cerevisiae CAT-1 and bacteria from Acetobacter sp. A-3. Finally, the metabolomes of bacteria and yeasts in the coexistence condition on fermentation assays were obtained by gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS) and liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC-MS). 3056, 2112 and 3557 genes were identified in the genomes of Lactobacillus sp. I-2, Lactobacillus sp. L-10 and Acetobacter sp. A-3, respectively. The yeasts from S. cerevisiae, regardless of the experimental condition evaluated, all the total reducing sugars (ART) present in sugarcane molasses were consumed and the ethanol production was consistent with that observed in first generation (1G) ethanolic fermentations. Glycine, an apolar amino acid containing only one hydrogen in the lateral chain, showed greater abundance during fermentations contaminated with lactic and acetic bacteria. It is speculated that the intracellular accumulation of this amino acid results from the shift of intermediates from the Glycolysis/Glycogenogenesis and the Citric Acid Cycle pathways to the production of nitrogen compounds. Probably, both microorganisms, bacteria and yeasts, used the intracellular accumulation of glycine as an alternative to nitrogen deficiency in sugarcane molasses in the fermentations carried out in bioreactors. The Bacterial genomes sequencing and fermentation assays in bioreactors were performed at the Brazilian Bioethanol Science and Technology Laboratory (CTBE) of the Brazilian Center for Research in Energy and Materials (CNPEM). The metabolomics analyzes were performed at the Max Feffer Laboratory of Plant Genetics at the \"Luiz de Queiroz\" School of Agriculture (ESALQ). It is hoped that the results presented in this work will add more information about the interactions among bacteria and yeasts and will contribute, in the near future, to new bacterial control strategies in Brazilian industrial fermentations that are more efficient and sustainable than those currently used.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-26082019-161826 |
| Date | 17 June 2019 |
| Creators | Lopes, Lucas Souza |
| Contributors | Labate, Carlos Alberto, Pachón, Diego Mauricio Riaño |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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