Les Archaea methanogènes sont des organismes environnementaux ayant été également détectés dans certaines flores associées aux muqueuses des mammifères. Chez l’homme ces microorganismes ont été associés avec les muqueuses intestinale, vaginale et orale. Ces organismes sont des procaryotes anaérobies stricts et leurs conditions de culture restent fastidieuses et très mal connues. En effet, uniquement trois Archaea methanogènes ont été cultivées à partir de prélèvements humains, Methanobrevibater smithii et Methanosphaera stadtmanae à partir des selles puis Methanobrevibater oralis à partir de la plaque dentaire. Récemment l’ADN d’autres Archaea methanogènes et d’Archaea non-methanogènes a été détecté dans des selles humaines, y compris des séquences indiquant la présence d’espèces appartenant à un nouvel ordre de méthanogènes n’ayant aucun représentant cultivé. La connaissance actuelle sur la diversité de ces methanogènes chez l’homme et sur leurs effets potentiels sur la santé humaine est en grande partie basée sur les techniques de détection de l’ADN par PCR et métagénomique. Ces techniques fondées sur la détection de l’ADN ribosomal 16S et du gène mcrA codant la sous-unité alpha du methyl-coenzyme M reductase, une enzyme clé dans le processus de méthanogenèse, ont montré dans un premier temps que M. smithii était détecté chez moins de 50% des individus et M. stadtmanae chez 0-20 % seulement. Ces résultats étaient contradictoires avec le rôle de la méthanogenèse dans l’élimination des acides et d’autres produits du processus digestion, et nous avons émis l’hypothèse que ces résultats pouvaient ne pas refléter la quantité réelle des méthanogènes dans le tube digestif humain, suggérant la mise au point de nouvelles méthodes de détection moléculaire et de culture adaptées aux caractéristiques de ces organismes fastidieux. Dans ce travail, nous nous sommes fixés comme premier objectif de mettre au point une méthode moléculaire permettant de détecter M. smithii chez tous les individus testés et nous avons mis au point un protocole d’extraction et de détection d’ADN d’Archaea à partir des selles en se basant sur les génomes séquencés de M. smithii et M. stadtmanae. Ce protocole nous a permis de détecter M. smithii chez 95,5% des individus et M. stadtmanae chez 29,4% des individus. En ce basant sur ce protocole et moyennant une approche moléculaire basée sur une PCR universelle de l’ADN ribosomal 16S des méthanogènes, le séquençage et le clonage, nous avons également détecté chez 4% de la population, une séquence correspondant à un phylotype (FJ823135) ayant déjà été rapporté comme représentant un nouvel ordre de méthanogènes. A partir de là, nous avons choisi un prélèvement de selle susceptible de contenir le plus fort ratio de FJ823135/ M. smithii et nous avons réussi à isoler et à cultiver une nouvelle Archaea que nous avons nommé Methanomassiliicoccus luminyensis, premier représentant cultivé d’un nouvel ordre de méthanogènes et la quatrième Archaea cultivée chez l’homme. M. luminyensis et M. stadtmanae présentent des métabolismes similaires en réduisant le méthanol en méthane en utilisant l’hydrogène comme donneur d’électrons, cette observation nous a incité à tester l’addition de tungstate de sélénium, requis pour la croissance de M. luminyensis, dans une culture M. stadtmanae, et nous avons observé une accélération de la vitesse de croissance de M. stadtmanae par un facteur 3. Nous avons ensuite étudié la sensibilité des méthanogènes isolés chez l’homme aux antibiotiques et établi qu’ils sont seulement sensibles à des molécules efficaces contre les bactéries et les eucaryotes, ceci étant en accord avec leur position phylogénétique en tant qu’un des quatre domaines de la vie. [...] / Methanogenic Archaea are environmental organisms which have also been associated to mammals mucosa. In humans these microorganisms have been detected in the vaginal, intestinal and oral mucosa. These organisms are strict anaerobes and their culture conditions remains fastidious and poorly known. In fact only three methanogens have been isolated from human samples, both Methanobrevibater smithii and Methanosphaera stadtmanae from stool and Methanobrevibater oralis from dental plaque. Current knowledge on the diversity of methanogens in humans and their potential effects on human health were largely based on DNA detection methods as PCR and metagenomics. These techniques based on 16S rDNA and mcrA gene (encoding the alpha subunit of methyl coenzyme-M-reductase, a key enzyme in methanogenesis process) detection, showed that M. smithii was the most present in man and that the presence of M. stadtmanae was transient. Recently, the DNA of other methanogenic and non- methanogenic Archaea, has been detected in human feces, including sequences indicating the presence of non-cultured species belonging to potential new order of methanogens with no cultured representative. However, these studies detected M. smithii with variable prevalence in less than half of the tested individuals and no M. stadtmanae; such results does not confirm the paramount role of methanogenesis in preventing the accumulation of acids and other reaction end products during the digestion process, and can not reflect the actual amount of these two methanogens in the human digestive tract because of their specific association with the intestinal mucosa. Therefore, these studies pointed that the diversity of methanogens in humans has been underestimated suggesting the development of new molecular detection methods and cultural approaches adapted these fastidious organisms. In this work, we preset as first criteria, the detection of M. smithii in all tested individuals, therefore we developed an improved protocol for archaeal DNA extraction and detection from stool based on sequenced genomes of M. smithii and M. stadtmanae, this protocol allowed us to detect the first one DNA in 95.5% tested individuals and the second in a prevalence of 29.4%. Based on this protocol and through molecular approach based on universal amplification of methanogenic 16S rDNA, sequencing and cloning, we detected in 4% of the tested population, a sequence corresponding to a new phylotype (FJ823135) that has been previously reported and proposed as a representative of a new order of methanogens. From there, we chose one stool specimen susceptible to contain the highest amount of FJ823135 and successfully isolated Methanomassiliicoccus luminyensis B10T clone, the first cultured representative of a new order of methanogens and the fourth Archaea cultured in humans.This archaeon exhibited a similar type of metabolism to that of M. stadtmanae by oxidizing H2 and reducing methanol to methane but require tungstate-selenite, an element essential for its growth, this fact prompted us testing tungstate-selenite addition on M. stadtmanae growth and establishing that it was strongly stimulatory with a growth rate three times faster. We have thereafter studied the sensitivity of methanogens isolated from humans to antibiotics and established that they are susceptible only to molecules also effective against both Bacteria and Eucarya, in agreement with their phylogenetic location as a unique domain of life. The aim of the latter part of this work was to test the effectiveness of MALDI-TOF mass spectrometry identification of environmental and host-associated Archaea. The obtained data indicated that that MALDI-TOF-MS protein profiling is an efficient first-line step for the rapid phenotypic identification of cultured Archaea organisms including host-associated ones. [...]
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2011AIX20682 |
| Date | 06 July 2011 |
| Creators | Dridi, Bédis |
| Contributors | Aix-Marseille 2, Drancourt, Michel |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
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