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Previous issue date: 2018-06-12 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Mycobacterium tuberculosis is the etiological agent of tuberculosis (TB), which is responsible in 2015 for
10.4 million new cases and 1.8 million casualties registered worldwide. To be able to avoid the defense
barriers of the host, the bacteria evolved mechanisms to modulate or change the environment it is in,
thereby, the secretion of bioactive molecules is an efficient strategy to do so. Among the bioactive
molecules produced by M. tuberculosis, proteases have a crucial role to a successful infection, as they are
involved in several important biological processes of the bacteria, such as DNA replication, cell proliferation
and antigen processing. Thus, proteases are good targets for the development of new anti-TB drugs or as
possible vaccine antigens. This work aimed to clone and express the gene Rv2467, a putative protease with
aminopeptidase activity from M. tuberculosis. To achieve this goal, oligonucleotides design were made to
amplify the gene Rv2467 by Polimerase Chain Reaction (PCR), which was cloned in the pGEM-T easy vector.
The clone Rv2467 gene was then transfere to the expression vector pET-28a. The recombinant protein was
expressed from the recombinant plasmid pET-28a/Rv2467 in Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS through
induction with IPTG. The recombinant protein, with the expected size of 94KDa, was expressed and
subjected to the purification process by nickel affinity chromatography. The recombinant protein was
partially purified only in its denatured form. The low yield of purified recombinant protein raised the
possibility of histidine tail loss. To verify that, Western Blotting with anti-histidine antibody was made and
it was verified that the antibody did not recognize the target Rv2467 protein, which made it impossible to
acquire the pure protein, not allowing further characterization tests. Additionally, a literature review was
performed about Mycobacterium tuberculosis proteases that are involved in virulence mechanisms to make
a manuscript to be submitted to a scientific journal / Mycobacterium tuberculosis é o agente etiológico da tuberculose (TB), que provocou em 2015, 10,4 milhões
de novos casos e 1,8 milhões de mortes registrados mundialmente. Para conseguir evadir as barreiras de
defesa do hospedeiro, a bactéria evoluiu criando mecanismos que modulam ou modificam o ambiente no
qual ela está inserida, sendo a secreção de moléculas bioativas uma estratégia eficiente para isso. Dentre
as moléculas bioativas produzidas por M. tuberculosis, as proteases desempenham papel crucial para o
sucesso da infecção, pois estão envolvidas em diversos processos biológicos importantes para a bactéria,
tais como replicação do DNA, proliferação celular, processamento de antígeno, entre outros. Deste modo,
as proteases se apresentam como alvo para novas drogas anti-TB ou como possíveis antígenos vacinais.
Com isso, o foco deste trabalho foi clonar e expressar o produto do gene Rv2467, uma suposta protease
com atividade aminopeptidase de M. tuberculosis. Para tanto foi realizado o desenho dos oligonucleotídeos
iniciadores para amplificar o gene Rv2467 por Reação da Polimerase em Cadeia (PCR) que foi clonado no
vetor pGEM-T easy. O inserto correspondendo ao gene Rv2467 foi retirado do vetor de clonagem e inserido
no vetor de expressão pET-28a. A proteína recombinante foi expressa a partir do plasmídeo recombinante
pET-28a/Rv2467 em Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS através de indução com IPTG. A proteína
recombinante, apresentando o tamanho esperado de 94 KDa, foi expressa e submetida ao processo de
purificação por cromatografia de afinidade ao níquel. A purificação parcial da proteína recombinante
somente foi possível de forma desnaturada, sendo que as tentativas de obtê-la de forma nativa para testar
atividade resultaram improdutivas. O baixo rendimento de purificação da proteína recombinante levou a
suspeitar da possível perda da cauda de histidina e, para tanto, realizou-se um Western Blotting com
anticorpo anti-histidina. Ao ver a revelação na membrana verificou-se que o anticorpo não reconheceu a
proteína Rv2467 o que impossibilitou obter a proteína pura não podendo seguir para futuros testes de
caracterização. Além de testes para obter a proteína em sua forma nativa foi escrito um manuscrito
científico de revisão da literatura sobre proteases de Mycobacterium tuberculosis envolvidas no mecanismo
de virulência.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.bc.ufg.br:tede/8693 |
| Date | 12 June 2018 |
| Creators | Andrade, Rayanny Gomes de |
| Contributors | Kipnis, André, Kipnis, Ana Paula Junqueira, Kipnis, André, André , Maria Cláudia Dantas Porfírio Borges, Steindorff, Andrei Stecca |
| Publisher | Universidade Federal de Goiás, Programa de Pós-graduação em Medicina Tropical e Saúde Publica (IPTSP), UFG, Brasil, Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública - IPTSP (RG) |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFG, instname:Universidade Federal de Goiás, instacron:UFG |
| Rights | http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/, info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | 6085308344741430434, 600, 600, 600, 600, -7769011444564556288, -203884118251241698, -2555911436985713659 |
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