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Previous issue date: 2016-10-07 / Outro / The several advantages of miniaturization of DNA amplification and coupling with sample preparation and detection steps on the same chip are well known. Currently, most miniaturized systems for nucleic acids analysis are based on polymerase chain reaction (PCR). PCR amplification requires precise temperature control, switching between heating and cooling solution in three specific temperatures. Therefore, the adaptation of PCR for microchip is relatively complex and presents some limitations particularly for use in remote locations. Without the need for heating cycles, isothermal microsystems for DNA amplification can be designed to be simple and low energy consumption and hence can overlap the portable PCR detection systems. The loop-mediated isothermal amplification (LAMP) is a novel technique which has emerged as a simple and fast tool for DNA amplification which can be used for the detection and identification of several pathogens. The LAMP using Bst DNA polymerase enzyme which is an enzyme having strand displacement activity and uses a set of four primers designed from six individual segments of the sequence to be amplified. In this study, we developed a simple and rapid LAMP reaction for the E. coli malB gene amplification in the reaction was thermally controlled with a thermoblock for 60 minutes at 66 ° C. The PeT microdevices demonstrated compatibility with all reagents used in the LAMP and the success of the isothermal amplification was observed by agarose gel electrophoresis, yielding detectable amount amplicons as few as starting with 1 copy of DNA. Moreover, the success of the nucleic acid amplification reaction was evaluated by visual detection of the amplicons in the microchip by the use of fluorescent DNA intercalators, which yielded fluorescence in positive reactions. The LAMP in PeT microdevice is a simple and inexpensive method, that allowed a rapid detection (62 minutes) of E. coli. Because of simple operation and without the need for sophisticated instrumentation, LAMP held in microchip PeT has proven to be a valuable tool for molecular diagnostics, with great potential for applications in point-of-care. / As diversas vantagens da miniaturização das reações de amplificação de DNA e o acoplamento com as etapas de preparo da amostra e de detecção no mesmo chip já são bem conhecidas. Até o presente momento, a maioria dos sistemas miniaturizados para a análise de ácidos nucleicos são baseados na reação em cadeia da polimerase (PCR). A PCR necessita de controle preciso de temperatura, alternando entre aquecimento e resfriamento da solução em três temperaturas específicas. Desta forma, a adaptação da PCR em microchips é relativamente complexa apresentando algumas limitações relacionadas principalmente a utilização em lugares remotos. Sem a necessidade de ciclos de aquecimento, os microssistemas isotérmicos podem ser projetados para serem simples e de baixo consumo de energia e, portanto, pode sobrepor a PCR em sistemas de detecção portáteis. A amplificação isotérmica mediada por loop (LAMP) é uma técnica recente e inovadora que surgiu como uma ferramenta simples e rápida de amplificação de DNA que pode ser utilizada para detecção e identificação de diversos patógenos. A LAMP utiliza a enzima Bst DNA polimerase que é uma enzima com atividade de deslocamento de fita e utiliza um conjunto de quatro iniciadores desenhados a partir de seis segmentos específicos da sequência a ser amplificada. Neste trabalho foi desenvolvida uma metodologia simples e rápida para detecção de E.coli através da amplificação isotérmica do gene malB em dispositivos descartáveis de poliéster-toner (PeT) contendo um microcâmara com capacidade para 5 μL, e a reação foi incubada a 66 ºC em um termobloco por 60 minutos. Os microchips de PeT demonstraram compatibilidade com todos os reagentes utilizados na LAMP e o sucesso da amplificação isotérmica foi observado por eletroforese em gel de agarose, obtendo quantidade de amplicons detectáveis no gel em reações que partiram de 1 cópia de DNA. Além disso, o sucesso da reação de amplificação do ácido nucleico também foi avaliado através da detecção visual dos produtos amplificados no microchip através do uso de intercaladores fluorescentes de DNA, que produziram fluorescência nas reações positivas. A LAMP realizada em microdispositivos de PeT representa um método simples e de baixo custo, que permitiu a detecção rápida (62 minutos) da E.coli. Devido a simples operação, e sem a necessidade de instrumentação sofisticada, a LAMP realizada no microchip de PeT demonstrou ser uma ferramenta valiosa para diagnósticos moleculares, apresentando grande potencial para aplicações no point-of-care.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.bc.ufg.br:tede/6663 |
| Date | 07 October 2016 |
| Creators | Oliveira, Kezia Gomes de |
| Contributors | Duarte, Gabriela Rodrigues Mendes, Bailão, Alexandre Melo, Duarte, Gabriela Rodrigues Mendes, Carrilho, Emanuel, Coltro, Wendell Karlos Tomazelli, Bailão, Alexandre Melo |
| Publisher | Universidade Federal de Goiás, Programa de Pós-graduação em Química (IQ), UFG, Brasil, Instituto de Química - IQ (RG) |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFG, instname:Universidade Federal de Goiás, instacron:UFG |
| Rights | http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/, info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | 663693921325415158, 600, 600, 600, 600, 7826066743741197278, -8661602105461439549, 2442915598251853972 |
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