Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Florianópolis, 2011 / Made available in DSpace on 2012-10-26T00:21:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1
289632.pdf: 1916144 bytes, checksum: 67af3bb6cca1c4c3c30dc049f92d0a4b (MD5) / O vírus da mionecrose infecciosa (IMNV) causa uma doença progressiva em camarões de cultivo com substanciais perdas econômicas no Brasil e na Indonésia. Métodos imunológicos simples e rápidos para a detecção do IMNV ainda não são disponíveis devido à falta de anticorpos monoclonais (AcMo) contra o vírus. Neste trabalho, dois fragmentos do gene da proteína do capsídeo do IMNV, abrangendo os aminoácidos 105-297 (IMNV105-297) e 300-527 (IMNV300-527), foram clonados e expressos em Escherichia coli. Ambas sequências nucleotídicas e aminoacídicas deduzidas de IMNV105-297 e IMNV300-527 apresentaram elevada identidade com sequências de IMNV isolados no Brasil (99%) e na Indonésia (98%). Dentre os hibridomas que foram obtidos, seis AcMo anti-rIMNV105-297 (1.1D, 1.3H, 3.3G, 3.9G, 4.6C, 5.4H) e dez AcMo anti-rIMNV300-527 (1.3G, 1.3H, 1.8C, 2.9C, 2.9E, 3.3A, 9.7F, 9.8D, 9.8H, 11.2D) foram selecionados para se avaliar suas reatividades contra a proteína do capsídeo viral presente em lisado de camarões infectados por IMNV. Nos ensaios de imunodot-blot, cinco AcMo anti-rIMNV105-297 e oito AcMo anti-rIMNV300-527 apresentaram distintas sensibilidades contra lisados de tecido muscular infectado por IMNV, bem como contra rMNV105-297 ou rIMNV300-527. Dentre esses, três AcMo anti-rIMNV105-297 (1.3H, 4.6C, 5.4H) e cinco AcMo anti-rIMNV300-527 (1.3H, 1.8C, 2.9E, 3.3A, 11.2D) demonstraram alta especificidade contra a proteína nativa do IMNV nos ensaios de Western-blot, visto que reconheceram somente uma proteína de 100 kDa - massa esperada para a proteína do capsídeo do IMNV. Nas imunohistoquímicas, dois AcMo anti-rIMNV105-297 (1.3H, 4.6C) e quatro AcMo anti-rIMNV300-527 (1.8C, 2.9E, 3.3A, 11.2D) ligaram-se a inclusões virais presentes em fibrose muscular e em áreas de necrose coagulativa. Concluindo, esses seis AcMo foram sensíveis e específicos em todos os imunoensaios realizados e poderão ser utilizados em testes de imunodiagnóstico de rotina para prevenção e controle da disseminação do IMNV. / Infectious myonecrosis virus (IMNV) has been causing a progressive disease in farm-reared shrimp with substantial economical loses in northeastern Brazil and Indonesia. Simple and rapid immunological methods for IMNV detection are not yet available due to the lack of monoclonal antibodies (MAbs) against the virus. In this report, two fragments of the IMNV major capsid protein gene, comprising amino acids 105-297 (IMNV105-297) and 300-527 (IMNV300-527), were cloned and expressed in Escherichia coli. Both nucleotide and deduced amino acid sequences of IMNV105-297 and IMNV300-527 displayed high identity to IMNV isolated from Brazil (99%) and Indonesia (98%). Among several clones secreting antibodies against the IMNV recombinant proteins, six MAbs anti-rIMNV105-297 (1.1D, 1.3H, 3.3G, 3.9G, 4.6C, 5.4H) and ten MAbs anti-rIMNV300-527 (1.3G, 1.3H, 1.8C, 2.9C, 2.9E, 3.3A, 9.7F, 9.8D, 9.8H, 11.2D) were selected to evaluate their reactivity against the native IMNV capsid protein from IMNV-infected shrimp. In immunodot-blot, five MAbs anti-rIMNV105-297 and eight MAbs anti-rIMNV300-527 presented distinct levels of sensitivities against IMNV-infected muscle tissue homogenate and against rIMNV105-297 or rIMNV300-527. From those, three MAbs anti-IMNV105-297 (1.3H, 4.6C, 5.4H) and five MAbs anti-IMNV300-527 (1.3H, 1.8C, 2.9E, 3.3A, 11.2D) demonstrated high specificity against the native IMNV protein in Western-blot, since they only recognized a 100 kDa protein - the predicted mass of IMNV capsid protein. In immunohistochemistry, two MAbs anti-rIMNV105-297 (1.3H, 4.6C) and four MAbs anti-rIMNV300-527 (1.8C, 2.9E, 3.3A, 11.2D) bound to viral inclusions present in muscle fibrosis and coagulative necrosis areas. In conclusion, these six MAbs were sensitive and specific in all immunoassays performed herein, and can be used in routine immunodiagnostic tests to prevent and control IMNV dissemination.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufsc.br:123456789/95337 |
| Date | 26 October 2012 |
| Creators | Seibert, Caroline Heidrich |
| Contributors | Universidade Federal de Santa Catarina, Pinto, Aguinaldo Roberto |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | 113 p.| il., grafs., tabs. |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFSC, instname:Universidade Federal de Santa Catarina, instacron:UFSC |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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