A investigação do processo de interação da enzima responsável pela hidrólise da biomassa lignocelulósica e das suas alterações estruturais são de suma importância no que diz respeito à otimização da produção do etanol de segunda geração proveniente da biomassa lignocelulósica. Neste contexto, metodologias óticas foram desenvolvidas e empregadas no presente trabalho na caracterização da interação enzimática com substrato celulósico. Basicamente, foram utilizadas espectroscopia de absorção Uv/vis, fluorescência e dicroísmo circular (CD). Fibras de eucalipto e celulose microcristalina (Avicel) foram usadas como substrato. Com o auxílio da fluorescência intrínseca da enzima Celobiohidrolase I de Thrichoderma harzianum (ThCBHI), foi possível desenvolver o método de arraste enzimático que nos permitiu determinar a dependência da interação enzima-substrato com o pH e a temperatura e estimar o número de enzimas adsorvidas na biomassa lignocelulósica. O efeito destes parâmetros sobre as estruturas secundárias da enzima ThCBHI e de sua influencia na interação enzimática também foi estudado. Medidas da seção choque efetiva de absorção demonstraram que a estrutura da ThCBHI sofreu grande influencia do pH e da temperatura, o que foi confirmado de forma complementar pela técnica de CD. Estimativas da fração de cobertura das enzimas na superfície do substrato indicam uma forte dependência da interação enzima-substrato com o pH e temperatura. Observou-se que essa interação é basicamente determinada pelas cargas efetivas acima e abaixo do ponto isoelétrico associado ao modulo de ligação à celulose, CBM. Além disso, o método colorimétrico Somogyi-Nelson (SN) permitiu quantificar com precisão pequenas quantidades de produto da hidrólise da biomassa pela enzima ThCBHI. Os resultados de atividade mostraram forte correlação entre o perfil de interação e as mudanças estruturais sofridas pela enzima ThCBHI. Com essa metodologia foi possível estimar a máxima atividade da ThCBHI durante 24 horas de reação. Os valores do produto nos permitiu computar atividades específicas de 0,1 U/mg e 0,2 U/mg para 25°C e 50°C, respectivamente. / The investigation of the interaction process of enzymes during hydrolysis of lignocellulosic biomass and the effect of structural changes are issues of fundamental importance in respect to optimization of ethanol second generation production. In this context, optical methodologies were developed and employed in the present work in the characterization of enzymatic interactions with cellulosic substrates. Basically, we used for this purpose absorption and fluorescence spectroscopy and circular dichroism (CD). Eucalyptus fibers and microcrystalline cellulose (Avicel) were used as substrate. The interaction between enzyme and substrate was determined by the use of enzymatic drag methodology by measuring directly the intrinsic fluorescence of the Thrichoderma harzianum Celobiohydrolases I (ThCBHI) enzymes as a function of the temperature and pH of the reaction medium. The effect of these parameters on the enzyme secondary structure was also subject of the present study. Furthermore, both effective cross-section and molar extinction coefficient of the ThCBHI were determined and correlated to structural changes due to temperature and pH, as confirmed by CD measurements. Estimation of the enzyme covering ration for eucalyptus fiber showed a strong dependence on both temperature and pH due to changes of the effective charges above and below the enzyme isoelectric point and to thermal effects on the enzymatic structure and on the enzyme-substrate interaction associated to the Carbohydrate Binding Modules (CBM). In addition, we use the Somogyi-Nelson methodology to measure very small amount of hydrolyses product. As a result, a strong correlation between interaction profile and ThCBH structural changes was demonstrated. Specific activities of 0,1 U/mg e 0,2 U/mg for 25°C e 50°C, respectively, were found for the eucalyptus fiber.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:teses.usp.br:tde-30072013-234905 |
| Date | 03 August 2012 |
| Creators | Fernando Rodrigues da Conceição |
| Contributors | Francisco Eduardo Gontijo Guimarães, Antonio Aprigio da Silva Curvelo, Ernesto Chaves Pereira de Souza |
| Publisher | Universidade de São Paulo, Ciência e Engenharia de Materiais, USP, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP, instname:Universidade de São Paulo, instacron:USP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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