A doença de Parkinson (DP) é considerada a segunda doença neurodegenerativa mais comum em idosos e é caracterizada pela presença de disfunções motoras decorrentes da redução de neurônios dopaminérgicos na substância negra pars compacta (SNpc). Uma das principais neurotoxinas utilizadas para o estudo de DP em modelos animais é a 6-hidroxidopamina (6-OHDA), que possui como mecanismo de neurotoxicidade a formação de espécies reativas de oxigênio (EROs). A liberação de EROs pela NADPH oxidase (Nox) e a ativação microglial constituem os eventos iniciais da neurodegeneração induzida pela 6-OHDA. A Nox2 está relacionada com a modulação dos fenótipos microgliais e encontra-se superativada na DP, levando a um desequilíbrio redox e a danos celulares. A microglia é o principal componente da defesa imune no sistema nervoso central (SNC) e é dependente do receptor fator 1 estimulador de colônias (CSF1R) para a sobrevivência. O inibidor de CSF1R é utilizado como método para depletar microglia em modelos de neurodegeneração e, consequentemente, compreender o impacto da sua eliminação no processo da doença. Baseado nisso, foram propostas duas abordagens para compreender o papel da microglia na progressão da DP induzida pela 6-OHDA, sendo que o primeiro investigou a modulação da ativação microglial pela Nox2 em camundongos nocautes para a subunidade gp91phox, enquanto que o segundo avaliou o impacto da depleção por meio do tratamento com 1200mg/Kg de PLX5622, um tipo de inibidor de CSF1R. Os animais naïves gp91phox-/- apresentaram aumento da proliferação de microglias e da expressão da enzima iNOS. Quando submetidos à 6-OHDA, os nocautes não apresentaram declínio motor em função do tempo avaliado pelo teste do cilindro, devido à maior sobrevivência de neurônios dopaminérgicos na SN em relação aos selvagens (WT). Um dos possíveis fatores relacionados à perda expressiva de neurônios nos WT foi a indução precoce da enzima iNOS, sugerindo que a ativação de Nox2 conjuntamente com iNOS na microglia aumenta os níveis de EROs tornando os neurônios mais susceptíveis à morte celular. Também foram observadas modulações temporais distintas entre os grupos com relação à expressão de CD86 e Arginase-1, além dos nocautes apresentarem baixos níveis de lesões oxidativas no DNA mitocondrial quando comparado com os WT. Assim, a ativação da Nox2 e da iNOS parecem atuar em sinergia no processo neurodegenerativo causado pela 6-OHDA. Por outro lado, os resultados com PLX5622 mostraram que a depleção microglial acelera o comprometimento da coordenação motora e da bradicinesia avaliado pelo teste do poste, bem como reduz o número de neurônios dopaminérgicos na SNpc. Além disso, a redução de células postivas para GFAP, do marcador CD68 e da regulação de genes ligados a microglia foram observados. O gene MeCP2, que está relacionado à via nigroestriatal e que consiste em um importante modulador da expressão de TH, está pouco expresso no grupo submetido à depleção microglial e a 6-OHDA. Esses achados sugerem que a deficiência na comunicação entre microglias e astrócitos, bem como a redução do nível de transcritos do gene MeCP2 causados pela depleção microglial, podem contribuir para a aceleração do processo neurodegenerativo causado pela 6-OHDA. / Parkinson\'s disease (PD) is considered the second most common neurodegenerative disease in elderly people and is characterized by the presence of motor impairment, which is a consequence of dopaminergic neuron loss in the substantia nigra pars compacta (SN). A major neurotoxin used for PD study in animal models is 6-hydroxydopamine (6-OHDA), which exerts neurotoxic effects through the production of reactive oxygen species (ROS). ROS release by the enzyme NADPH oxidase (Nox) and microglial activation are early events of neurodegeneration induced by 6-OHDA. Nox2 is related to modulation of microglia phenotypes and is overactivated in PD, which can lead to redox imbalance and cellular damage. Microglial cells are the main components of immune defense in the central nervous system and are dependent upon Colony-stimulating factor 1 receptor (CSF1R) for survival. The CSF1R inhibitor is used with a tool to deplete microglia in models of neurodegenerative diseases and, consequently, to understand the impact of its elimination in the disease process. Based on that, we proposed two approaches to evaluate the microglial role in the PD progression induced by 6-OHDA, in which the first one investigated the modulation of microglial activation by Nox2 in gp91phox knockout mice, whereas the second one evaluated the impact of microglial depletion through a treatment with 1200 mg/Kg of PLX5622, one type of CSF1R inhibitor. The gp91phox-/- naïve mice showed an increase of microglia proliferation and in the iNOS expression. When the knockout mice were submitted to 6-OHDA, they did not have motor impairments as a function of toxin exposure as evaluated by cylinder test. This result is due to the increase number of dopaminergic neurons survival in SNpc compared to wild type (WT). One of the possible factors involved in neurons death in WT was the early iNOS induction, which indicates that Nox2 and iNOS simultaneous activation in microglial cells enhance ROS levels, leading to neurons more vulnerable to cell death. Moreover, the expression of CD86 and Arginase-1 have differences in temporal modulation between both groups, as well as knockout mice showed lower levels of oxidative damage in mitochondrial DNA when compared with WT. Thus, the activation of Nox2 and iNOS could act sinergically in the neurodegenerative process caused by 6-OHDA.On the other hand, results with PLX5622 indicated that the microglial depletion aggravates the impairment of bradykinesia and motor coordination evaluated by pole test, as well as the reduction of tyrosine hydroxylase (TH) positive neurons in the SNpc. Moreover, the decrease of GFAP positive cells, of CD68 marker and regulation of genes linked to microglia were observed. The MeCP2 gene, related to the nigrostriatal pathway and an important modulator of TH expression, is down-regulated in the group with microglial elimination and submitted to 6-OHDA. These findings suggest that the deficiency of crosstalk between astrocytes and microglia, as well as the reduced MeCP2 transcript levels may contribute to the acceleration of neurodegenerative process initiated by 6-OHDA.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-18092019-145844 |
| Date | 27 June 2019 |
| Creators | Pereira, Carolina Parga Martins |
| Contributors | Britto, Luiz Roberto Giorgetti de |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Reter o conteúdo por motivos de patente, publicação e/ou direitos autoriais. |
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