Retinale Hypoxie ist ein wichtiger Faktor bei der Pathogenese der altersbedingten Makuladegeneration (AMD), einer Erkrankung, die mit einer chronischen Entzündungsreaktion einhergeht. Das angeborene Immunsystem besitzt eine Vielzahl von Mechanismen, um pathogene Faktoren zu erkennen und zu eliminieren. Dazu gehört u.a. das NLRP3-Inflammasom, das wahrscheinlich auch bei der AMD in der Netzhaut aktiviert ist. Die Aktivierung des Inflammasoms ist ein Zweischrittprozess: der erste Schritt, das Priming, besteht in der Transkription von NLRP3-assoziierten Genen. Im zweiten Schritt kommt es zu einer Assemblierung der Inflammasombestandteile, so dass das aktivierte Inflammasom pro-IL-1ß in das biologisch aktive IL-1ß umwandelt. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es herauszufinden, ob Hypoxie in kultivierten humanen retinalen Pigmentepithelzellen (RPE)-Zellen die Transkription und Aktivierung des NLRP3-Inflammasoms induziert. Es sollte auch ermittelt werden, welche Signalwege die hypoxischen Veränderungen der Genexpression von NLRP3 und des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors (VEGF-A) vermitteln. Dafür wurden Untersuchungen an humanen RPE-Zellen, die in 0,2% O2 bzw. in Anwesenheit von CoCl2 kultiviert wurden, durchgeführt.
Hypoxie bewirkte keine Veränderungen der Genexpression der Inflammasom-assoziierten Proteine NLRP1, NLRP6, NLRP7, NLRP12 und NLRC4, wohingegen die Expression der NLRP3- und IL-1ß-Gene sowie der NLRP3- und IL-1ß-Proteingehalt in RPE-Zellen erhöht wurden. Verschiedene Signalwege vermitteln die Hypoxie-induzierte Transkription des NLRP3-Gens. Hierzu zählen die Transkriptionsfaktoren CREB und HIF, Proteinkinase A, IP3-Rezeptoren, calcium-bindende Proteine, TRP- und SOS-Kanäle sowie autokrine/parakrine Aktivierung von EGF-, TGF-ß1-, FGF- und IL-1ß-Rezeptoren. Desweiteren wurde auch eine Beteiligung der autokrin/parakrinen Aktivierung von purinergen Rezeptoren an der hypoxischen NLRP3-Genexpression nachgewiesen. Eine Pannexin-abhängige Freisetzung von ATP trägt über eine Aktivierung von P2Y2- und Adenosin-A1-Rezeptoren zur hypoxischen Expression des NLRP3-Gens bei. Die Aktivierung der P2Y2-Rezeptoren trägt auch zur hypoxischen Expression und Sekretion von VEGF bei. Es konnte auch gezeigt werden, dass eine durch lysosomale Destabilisierung bewirkte Aktivierung des NLRP3-Inflammasoms eine Verringerung der RPE-Zellviabilität unter hypoxischen Bedingungen bewirkt.
Die Daten lassen vermuten, dass Hypoxie ein Faktor ist, der ein Priming und eine Aktivierung des NLRP3-Inflammasoms in RPE-Zellen bewirkt. Dies könnte eine retinale Inflammation und eine Degeneration der RPE-Zellen begünstigen. Eine Aktivierung von P2Y2-Rezeptoren trägt sowohl zur Aktivierung des NLRP3-Inflammasoms als auch zur Produktion des angiogenen Faktors VEGF-A in RPE-Zellen bei.:Inhaltsverzeichnis
1. Abkürzungsverzeichnis
2. Einführung
2.1. Das retinale Pigmentepithel-Aufbau und Funktionen
2.2. Die Altersbedingte Makuladegneration (AMD)
2.2.1. Epidemiologie und Ätiologie
2.2.2. Pathophysiologie und Klassifikation der AMD
2.2.2.1. Frühe AMD
2.2.2.2. GA und CNV – Spätformen der AMD
2.3. Zusammenhang zwischen AMD und Immunsystem
2.4. Das NLRP3-Inflammasom
2.4.1. Signalerkennung, Rezeptoren und Aufbau des NLRP3-Inflammasoms
2.4.2. Aktivierung des Inflammasoms
2.4.3. Wirkung von inflammatorischen Prozessen und Zytokinen auf die RPE-Zelle
2.5. Komplementsystem und AMD
2.6. Therapie der AMD
3. Aufgabenstellung
4. Materialien und Methoden
4.1. Materialien
4.1.1. Chemikalien
4.1.2. Substanzen zur Zellstimulation
4.1.3. Geräte und Sonstige Materialien
4.1.4. Primerpaare
4.1.5. Antikörper für die Western-Blot-Analyse
4.1.6. ELISA
4.2. Methoden
4.2.1. Zellkultivierung und Zellstimulation
4.2.2. Zellvitalität
4.2.3. RNA Präparation
4.2.4. cDNA Synthese
4.2.5. Quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR)
4.2.6. Agarose – Gelelektrophorese
4.2.7. siRNA Transfektion
4.2.8. ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)
4.2.9. Western-Blot, Proteinbestimmung nach Bradford und SDS-PAGE
4.3. Statistische Auswertung
5. Ergebnisse
5.1. Genexpression von Inflammasom-assoziierten Proteinen
5.2. Wirkung von Hypoxie auf die Genexpression von Inflammasomproteinen
5.3. Hypoxisch induzierte Expression von NLRP3 und IL-1ß Protein
5.4. RPE Zellvitalität
5.5. Regulation der Genexpression von NLRP3 und VEGF unter hypoxischen Bedingungen
5.5.1. Transkriptionsfaktoren
5.5.2. Beteiligung intrazellulärer Signalkaskaden
5.5.2.1. NLRP3 mRNA Expression
5.5.2.2. VEGF-A mRNA-Expression
5.5.3. Beteiligung von extrazellulären Signalproteinen
5.5.3.1. NLRP3 mRNA-Expression
5.5.3.2. VEGFA-mRNA-Expression
5.5.4. Beteiligung purinerger Rezeptoren
5.5.4.1. NLRP3 mRNA Expression
5.5.4.2. VEGF-A mRNA-Expression
5.5.5. Rolle purinerger Rezeptoren bei der Hypoxie-induzierten Sekretion von VEGF
6. Diskussion
6.1. Hypoxie induziert Priming und Aktivierung des NLRP3-Inflammasoms
6.2. Hypoxie-induzierte Signalwege, die die Expression von NLRP3 und VEGF-A regulieren
6.2.1. Transkriptionsfaktoren
6.2.2. Intra- und extrazelluläre Signaltransduktion
6.2.3. Rolle purinerger Rezeptoren bei der hypoxischen Expression von NLRP3 und VEGF
6.3. Chemische Hypoxie vs. Kultivierung in 0,2% O2
6.4. Einfluss der Inflammasomaktivierung auf die Expression und Sekretion von VEGF in RPE-Zellen
6.5. Mögliche klinische Bedeutung der Ergebnisse für die AMD
7. Zusammenfassung
8. Literaturverzeichnis
9. Anhang
9.1. Danksagung
9.2. Abbildungsverzeichnis
9.3. Lebenslauf
9.4. Eigenständigkeitserklärung
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa:de:qucosa:36967 |
| Date | 06 January 2020 |
| Creators | Doktor, Fabian |
| Contributors | Universität Leipzig |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | German |
| Detected Language | German |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, doc-type:doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, doc-type:Text |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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