Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Upon the current need for research with TiO2 nanocrystals (TiO2 NCs) properly characterized in order to evaluate their biological effects, this work was done aiming to synthesize and characterize TiO2 NCs, and evaluate their biocompatibility. The nanoparticles were synthesized by the precipitation in aqueous solution technique, and characterized by the techniques of X-ray diffraction, micro-Raman and spectrophotometry. To evaluate the biocompatibility, TiO2 NCs were tested in vivo using subcutaneous implants using Balb/c mice at a dose of 1g/kg for 15, 30 and 90 days for later histological analysis of the groups of 15 and 90 days and transmission electron microscopy of the group 30 days. In vitro evaluation consisted of cell viability assays, detection and measurement of nitric oxide metabolites and measurement of cytokine production in situ and in cultured macrophages challenged with different concentrations of TiO2 NCs. Cell viability was assessed after 72 hours by the MTT colorimetric assay, using five different concentrations of a solution of 10μg/ml, 20μg/ml, 40μg/ml, 100μg/ml and 200μg/ml in culture challenge of peritoneal macrophages Balb/c mice with 2, 12, 24 and 72 hours. From the supernatant of cultures of peritoneal macrophages was evaluated the production of nitrite by the Griess method and dosage levels of TNF-α, IL-1β, IL-12, IFN- and IL-4 by ELISA. The same technique was used for the determination of cytokine levels obtained from subcutaneous tissues underwent implantation of TiO2 NCs. After analysis of the data distribution by Kolmogorov-Smirnov test, we proceeded to their analysis by the Kruskal-Wallis test with Bonferroni post-test. The experiments of synthesis and characterization resulted in TiO2 nanocrystals of 8.5 nm on average, mixed phase, high purity level and quantum confinement effects. Histological analysis of the 15 days group showed a intense granulomatous nonspefic type inflammatory response with signs of necrosis and hemorrhage, which progressed with a slight reduction in its intensity, observed especially at 90 days of observation. Presence of clusters of nanocrystals with macroscopic dimensions, surrounded by macrophages and multinucled giant cells forming granulomas with fibrous capsules, which could be regarded as a typical reaction of granulomatous foreign body type and more intense fibrosis formation at 90 days within the material deployed. Nanocrystals were identified in lymph nodes in the different periods of study, suggesting that these particles might be transposed. Electron microscopy confirmed the evidence of apoptosis and vacuolar degeneration. The MTT test resulted in 40% viable cells in only 10 and 20μg/ml. The in vitro cytokine assay showed that there was not a tendency dose or time-dependent samples, presenting different behavior of TNF-α, IL-1β, IL-12 and increased production of IFN- probably due to low production of IL -4. The nitrite production was higher in the samples of 10μg/ml. The production of all cytokines in vivo experiment by the 15 days group was enhanced, decreasing in a time-dependent fashion, collaborating with the findings in vivo. We conclude that the TiO2 nanocrystals present in the tested concentrations presented inflammatory effects in vivo, cytotoxic and inflammatory conditions in vitro. These findings show that the experimental conditions studied NCs are not biocompatible. / Mediante a atual necessidade de pesquisas com nanocristais de TiO2 (NCs TiO2) devidamente caracterizados a fim de se avaliar seus efeitos biológicos, realizou-se este trabalho que teve como objetivos a síntese e caracterização dos NCs TiO2, e a avaliação de sua biocompatibilidade. As nanopartículas foram sintetizadas pela técnica da precipitação via solução aquosa, e caracterizadas por meio das técnicas de difração de raios-X, micro-Raman e espectrofotometria. Para a avaliação da biocompatibilidade, os NCs TiO2 foram submetidos a testes in vivo por meio de implantes subcutâneos utilizando camundongos Balb/c na dose de 1g/kg, por 15, 30 e 90 dias para posterior análise histológica dos grupos de 15 e 90 dias e microscopia eletrônica de transmissão do grupo de 30 dias. Avaliação in vitro consistiu de ensaios de viabilidade celular, detecção e mensuração de metabólitos do óxido nítrico e mensuração da produção de citocinas in loco e em cultura de macrófagos desafiados por diferentes concentrações de NCs TiO2. A viabilidade celular foi avaliada após 72 horas pelo teste colorimétrico MTT, utilizando-se cinco concentrações diferentes de solução de 10μg/ml, 20μg/ml, 40μg/ml, 100μg/ml e 200μg/ml, em desafio de cultura de macrófagos peritoneais de camundongos Balb/c por 2, 12, 24 e 72 horas. Do sobrenadante de culturas de macrófagos peritoneais avaliou-se a produção de nitrito pelo método de Griess e dosagem dos níveis das citocinas TNF-α, IL-1β, IL-12, INF- e IL-4 por ELISA. A mesma técnica foi utilizada para a dosagem dos níveis de citocinas obtida dos tecidos subcutâneo submetido ao implante de NCs TiO2. Após a análise da distribuição dos dados pelo teste Kolmogorov-Smirnov, procedeu-se a sua análise por meio do teste de Kruskal-Wallis com pós-teste de Bonferroni. Os experimentos de síntese e caracterização resultaram nanocristais de TiO2 de 8,5nm em média, fase mista, alto grau de pureza e efeitos de confinamento quântico. As análises histológicas do grupo de 15 dias evidenciaram uma resposta inflamatória do tipo granulomatosa inespecífica intensa com sinais de necrose e hemorragia, que evoluiu com discreta redução em sua intensidade, constatada em especial aos 90 dias de observação. Presença de aglomerados de nanocristais de dimensões macroscópicas, rodeados de macrófagos e células gigantes multinucleadas formando granulomas, com cápsulas fibrosas, que poderiam ser consideradas como uma reação típica do tipo granulomatosa de corpo estranho e formação de fibrose mais intensa aos 90 dias no interior do material implantado. Houve a identificação dos nanocristais nos linfonodos nos diferentes períodos de estudo, sugerindo que estas partículas possam ser carreadas a distância. A microscopia eletrônica confirmou a evidência de apoptose e degeneração vacuolar. O teste MTT resultou em 40% de células viáveis somente em 10 e 20μg/ml. A dosagem de citocinas in vitro demonstrou que não houve uma tendência dose ou tempo dependente das amostras, apresentando comportamentos distintos de produção de TNF-α, IL-1β, IL-12 e maior produção de INF- devido provavelmente à baixa produção de IL-4. A produção de nitrito foi maior nas amostras de 10μg/ml. A produção de todas as citocinas do experimento in vivo pelo grupo de 15 dias foi acentuada, decrescendo de forma tempo dependente, colaborando com os achados in vivo. Conclui-se que os nanocristais de TiO2 nas concentrações testadas apresentaram efeitos inflamatórios in vivo, citotóxicos e inflamatórios in vitro. Estes achados atestam que nas condições experimentais utilizadas os NCs estudados não são biocompatíveis. / Mestre em Odontologia
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/urn:repox.ist.utl.pt:RI_UFU:oai:repositorio.ufu.br:123456789/16986 |
| Date | 28 August 2013 |
| Creators | Brito, Patrícia de Freitas Leucas |
| Contributors | Silva, Cláudio Vieira da, Dantas, Noelio Oliveira, Loyola, Adriano Mota, Dechichi, Paula, Oliveira, Paulo Tambasco de |
| Publisher | Universidade Federal de Uberlândia, Programa de Pós-graduação em Odontologia, UFU, BR, Ciências da Saúde |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFU, instname:Universidade Federal de Uberlândia, instacron:UFU |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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